大豆咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)基因克隆及结构分析

【目的】对大豆中咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)基因进行克隆和生物信息学分析,为研究木质素代谢途径关键基因CCoAOMT在大豆抗胞囊线虫的作用机制奠定基础。【方法】以高抗大豆胞囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe)3号生理小种品种灰皮支黑豆根系为材料,利用RT-PCR技术进行克隆。【结果】克隆得到1条大豆CCoAOMT基因的cDNA全长序列,将其命名为GmCCoAOMT,GenBank登录号为MW480860。该基因全长为848 bp,含有1个741 bp的开放阅读框,编码246个氨基酸组成的蛋白,分子量为27.6 kDa,等电点为5.67;亚细胞定位预测显示,CCoAOMT蛋白可能位于细胞质,该蛋白含有1个保守的AdoMet_MTases结构域,属于AdoMet_MTases超级家族;在与其他豆科植物CCoAOMT编码的蛋白序列比对及系统进化树分析中,GmCCoAOMT编码的蛋白序列与其他豆科植物具有较高的相似性。【结论】获得大豆CCoAOMT基因的cDNA全长序列,通过构建进化树确定大豆与豇豆、木豆、菜豆和赤豆的CCoAOMT蛋白进化关系较近,而与白羽扇豆和鹰嘴豆进化关系较远。

龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因的克隆和表达分析

【目的】克隆龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因,分析其序列特征和在低温胁迫下不同组织中的表达情况并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从龙眼叶片中克隆DLCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR研究DLCCoAOMT基因在不同组织中的表达。【结果】克隆得到DLCCoAOMT基因,GenBank登录号为JN093023。该cDNA全长993 bp,具有1个744 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸。序列分析表明,DLCCoAOMT编码的氨基酸序列与其它植物的CCoAOMT蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,龙眼DLCCoAOMT与桦木属的CCoAOMT蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量技术进行组织表达模式分析发现,DLCCoAOMT基因在根、茎、叶中均有表达。总体上表达量在根和茎中较多,叶中较少,随着低温胁迫时间延长,DLCCoAOMT基因在各组织的表达量也发生变化。原核表达结果表明,DLCCoAOMT基因在大肠杆菌中获得表达。【结论】从龙眼中克隆到咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因,该基因可能参与调控低温胁迫。

梨咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因PbCCoAOMT1的功能验证

石细胞团的含量及大小是决定梨果实品质的关键因素之一。目前已知木质素是石细胞主要组成成分,而梨中木质素合成关键酶CCoAOMT的功能目前尚不明晰。为此,克隆PbCCoAOMT1编码区全长(MF346688.1)并构建真核表达载体pCAMBIA1301a-PbCCoAOMT1。通过农杆菌介导的浸花法将PbCCoAOMT1转化野生型拟南芥,利用分子检测确定获得阳性过表达PbCCoAOMT1拟南芥株系后,对其纯合T3代株系花序茎进行木质素及次生细胞壁特异性染色。结果表明,在拟南芥中过表达PbCCoAOMT1可以一定程度上促进次生壁的发育及木质化。运用溴乙酰法测定拟南芥花序茎中木质素含量发现,转基因植株中木质素含量较野生型显著上升,为野生型的1.24倍。进一步说明PbCCoAOMT1在木质素生物合成中具有重要作用。

棉花咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆及表达

根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术首次从棉花中克隆了一个CCoAOMT基因,命名为GhCCoAOMT1(GenBank登录号为FJ848871)。研究结果表明:GhCCoAOMT1基因cDNA全长960bp,具有一个753bp的开放阅读框,5′非编码区为9bp,3′非编码区为198bp,编码250个氨基酸,预测分子量约为28.306kDa,等电点为5.39。利用PCR方法克隆了GhCCoAOMT1基因的基因组序列,长度为1311bp,包含5个外显子和4个内含子。氨基酸同源性分析发现,GhCCoAOMT1与来自毛白杨、烟草和苎麻的CCoAOMT同源性较高。半定量RT-PCR检测表明,GhC-CoAOMT1基因在棉花各个组织中都有表达,其中茎部的表达量最高,其次表达量依次为根>花瓣>子叶>10d纤维>雄蕊>胚珠>叶。

绿竹咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆与分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。采用RT-PCR及RACE方法从绿竹中分离了CCoAOMT家族的一个基因,命名为BoCCoAOMT1(GenBank注册号为EF028662)。BoCCoAOMT1的cDNA全长873bp,含有一个780bp的读码框,编码一个259aa的蛋白,分子量约为29kD。序列分析结果表明,BoCCoAOMT1的编码肽链含有CCoAOMT类基因所有的保守序列元件,与禾本科植物水稻的CCoAOMT类基因有着很高的一致性,达到90.0%。系统进化树分析表明,BoC-CoAOMT1与水稻的CCoAOMT亲缘关系较近。

棉花咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析

根据棉花纤维特异表达cDNA文库得到的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个CCoAOMT基因,命名为GhCCoAOMT2。GhCCoAOMT2基因cDNA(GenBank登录号为FJ376606)具有一个747 bp的开放阅读框,5′非编码区为12 bp,3′非编码区为243 bp,编码248个氨基酸,预测分子量约为28.023 kD,等电点为5.39。GhCCoAOMT2基因组序列长度为1 442 bp,包含4个外显子和3个内含子。氨基酸同源分析发现,GhCCoAOMT2与来自毛白杨、烟草和苎麻的CCoAOMT同源性较高。半定量RT-PCR检测表明,GhCCoAOMT2基因在棉花各个组织中都有表达,其中茎部的表达量最高。原核表达分析表明,最佳诱导表达条件为0.2 mmol/LIPTG在37℃下诱导6 h。

甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶提高植物抗逆性功能分析

为研究甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(BvM14-CCoAOMT)的功能,本研究采用叶盘法将M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因转化烟草,获得T1代转基因植株,而后以野生型及转空载体植株为对照,分别在对照、100 mmol/L NaCl、200 mmol/L NaCl、100 mmol/L甘露醇及200 mmol/L甘露醇的培养条件下进行植株的抗逆性分析。研究发现在100、200 mmol/L NaCl盐胁迫条件下,转基因植株的鲜重、木质素含量以及叶绿素含量均显著高于对照植株。此外转基因植株在100 mmol/L甘露醇胁迫条件下根长和叶绿素含量显著高于对照植株,根长和叶绿素含量分别为0.68 cm和0.31 mg/(g·鲜重),而野生型植株的根长和叶绿素含量分别为0.51 cm和0.18 mg/(g·鲜重)。转M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因烟草植株对盐和干旱胁迫具有较强抗性,这为进一步深入研究M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因功能奠定重要基础。

苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因原核表达及其结构分析

为了研究苎麻木质素合成关键酶——咖啡酰辅酶A-甲基转移酶(CCoAOMT)基因编码的酶蛋白,了解其结构特点;采用原核表达系统——大肠杆菌表达系统pQE,对苎麻CCoAOMT cDNA编码区进行了高效表达,获得了分子量为29.4kD的苎麻CCoAOMT融合蛋白。采用SwissModel服务器模拟构建了该酶蛋白的空间结构。并利用InsightII软件包中的Docking模块构建了该酶蛋白与辅酶Sinapoyl、SAH和Ca2+相互作用的复合物的结合模型,并利用Discover模块对模拟的结构进行结构优化。可以推知所克隆的苎麻CCoAOMT cDNA编码了咖啡酰辅酶A甲基转移酶,具有O-甲基转移酶蛋白典型的催化功能,参与苎麻木质素单体前体的甲基化反应。

水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的原核表达、抗体制备和应用

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(caffeoyl coenzyme A-O-methyltransferase,CCoAOMT)在植物木质素生物合成过程中发挥重要作用。目前关于水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的研究主要集中在基因水平,对其在蛋白水平上的功能研究却相当少。通过PCR扩增技术克隆得到OsCCoAOMT1基因,并成功构建了原核表达载体pET30a(+)-OsCCoAOMT1,转化大肠杆菌,表达出了重组蛋白。蛋白经纯化后,注射新西兰公兔,成功制备了多克隆抗体。Western blot检测表明该抗体能特异性地结合水稻不同组织的该蛋白。利用制备的抗体对水稻茎原生质体进行免疫荧光标记,激光共聚焦显微镜观察发现在Ubi:OsCCoAOMT1-GFP转基因水稻和野生型水稻原生质体里均可标记到该蛋白的信号,且转基因水稻融合蛋白的GFP信号可以与该蛋白抗体的荧光信号共定位,同时结合水稻核质蛋白分离的Western blot检测结果可知OsCCoAOMT1蛋白在主要分布在细胞质中。表明制备的抗体能用于该蛋白的特异性检测,为后续对水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的功能研究奠定了良好基础。

棉花甲基化酶基因COMT和CCoAOMT的组织特异性表达分析

本研究利用半定量RT-PCR分析方法探索了陆地棉(Gossypium hirsutum L.)木质素合成途径中甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况。结果表明COMT1,COMT2,COMT3和CCoAOMT1,CCoAOMT2在棉花的7个组织器官(根、茎、叶、子叶、花瓣、雄蕊、胚珠)中都有表达,其中COMT1和CCoAOMT1在各组织中的表达趋势类似,COMT2,COMT3和CCoAOMT2表达趋势各异。在5～25d的棉纤维发育过程中,COMT1和COMT3表达稳定,COMT2表达量逐渐增加。而CCoAOMT基因家族的2个基因的表达量变化相对明显,CCoAOMT1在25d出现表达高峰,CCoAOMT2则在10d和15d呈现高表达量。本研究表明甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在棉花的根,茎等维管组织中具有相对一致的高表达量,而在其他组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。

水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(CCoAOMT)表达特性分析

咖啡酰辅酶A-0-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的关键酶.从水稻(Oryzasativa L ssp japonica)中分离了CCoAOMT基因家族的3个成员OsCOAl,OsCOA20和OsCOA26.序列分析表明,OsCOAl基因由4个外显子和3个内含子组成,OsCOA20和OsCOA26则具有3个外显子和2个内含子.这3个基因与其他植物同类CCoAOMT氨基酸同源性较高,达75.43%,并具有CCoAOMT基因特有的保守序列元件.系统进化树分析表明,OsCOAl与玉米中CCoAOMT具有较近的亲源关系,OsCOA20和OsCOA26则属于另一分支.Northern 印迹和组织原位杂交结果显示,3个基因的mRNA在水稻的各组织均有积累,在幼叶的厚壁组织和维管束大量表达,说明该基因家族的3个成员与水稻的木质化进程关系密切.

木质素合成关键酶咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶的研究进展

木质素是植物次生细胞壁的主要组分,其合成涉及多个酶的参与。其中咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase,CCoAOMT)是植物木质素合成中的一个关键酶,能催化咖啡酰辅酶A(caffeoyl-CoA)生成阿魏酰辅酶A(feruloyl-CoA),主要参与G-木质素的合成。本文综述了CCoAOMT的特征、功能及其在木质素生物合成中的调控作用,展望了该基因的研究方法及其在生产中的应用。

铁皮石斛咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因的分离与表达分析

目的分离珍稀濒危药用植物铁皮石斛咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶（caffeoyl CoA O-methyltransferase,CCoAOMT）基因（DoOMT）并进行生物信息学和表达模式分析。方法采用RT-PCR和RACE技术获取基因cDNA全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和三维建模等分子特性;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助实时定量PCR检测基因表达模式。结果分离到DoOMT（GenBank注册号KF876839）,cDNA全长1 005 bp,编码一条由239个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为2.708×10-4,等电点5.03;DoOMT蛋白不含跨膜域和信号肽,具有氧甲基转移酶family 3、甲基转移酶的保守结构域（13~238、31~238）和8个保守基序;DoOMT与植物CCoAOMTs蛋白一致性为49.4%~78.7%,所在分支隶属于CCoAOMTs分子进化的1b类群,与单子叶植物香草亲缘关系最近;DoOMT基因转录本在石斛根、茎、叶器官中为组成型表达,茎中相对表达量较高,为叶中的4.562倍,根和叶中无显著差异。结论铁皮石斛CCoAOMT基因DoOMT的分子特征为进一步研究其在铁皮石斛次生代谢和生长发育过程中的作用奠定基础。

菘蓝中咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因克隆与表达特征

咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶是植物中参与木脂素前体松柏醇生物合成的关键酶,为了研究菘蓝中CCoAOMT的表达特征,采用c DNA末端快速扩增(RACE)、PCR克隆IiCCoAOMT的全长cDNA及其基因组DNA序列;通过RT-qPCR检测比较IiCCoAOMT在四倍体菘蓝和二倍体菘蓝各器官中的表达以及不同胁迫刺激下的表达情况。IiCCoAOMT的c DNA序列全长1 098 bp (GenBank登录号:DQ115904),含774 bp的开放阅读框(ORF),编码257个氨基酸残基,对应的DNA序列含有5个外显子和4个内含子。多重序列比对结果显示Ii CCoAOMT与拟南芥At CCoAOMT同源性最高,且含有植物氧甲基转移酶-I的三个特征元件:motif A、motif B、motif C。在两种倍性菘蓝的根和叶中,四倍体表达量高于二倍体,而在两种倍性菘蓝的茎中表达量接近相同。冷处理(4℃)、盐处理(NaCl)、茉莉酸甲脂(MeJA)、赤霉素(GA_(3))、脱落酸(ABA)和水杨酸(SA)均能诱导IiCCoAOMT表达水平的上调。首次从菘蓝中克隆得到IiCCoAOMT并进行了表达特征研究,为进一步阐明菘蓝多倍性优势的分子机制提供理论基础,也为通过基因工程技术提高菘蓝中活性木脂素的含量提供了条件。

茶树CCoAOMT原核表达及酶促条件优化

优化了重组茶树咖啡酰辅酶A–O–甲基转移酶基因(CCoAOMT)在大肠杆菌中的表达,采用Ni–NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)为底物,进行体外酶促反应,采用HPLC测定反应产物EGCG3"Me的生成量。结果表明,CCoAOMT在E.coliBL21中能够高效表达,最优条件为诱导温度37℃,诱导时间4 h,异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mmol/L;重组蛋白经Ni–NTA亲和层析柱梯度洗脱达到了较好的纯化效果;重组酶在体外能够催化EGCG,合成EGCG3"Me,底物EGCG最佳浓度为0.05 mmol/L,最适温度为37℃,最适pH值为4。

苎麻CCoAOMT基因全长cDNA克隆与序列分析

目的试图分离和克隆苎麻内源咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因。方法采用RACE技术克隆基因,对序列应用ClustaW1.82软件进行在线分析,将苎麻mRNA序列、mRNA编码区序列以及氨基酸序列与已报道的其它植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树。结果获得了苎麻CCoAOMTcDNA全长序列(GenBank注册号:AY651026);苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶是氧甲基转移酶类;苎麻CCoAOMT基因mRNA序列与已报道的其他植物的相应序列不能聚为一类,其差异明显大于其它植物间的差异。苎麻CCoAOMT基因mRNA编码区序列与玉米(Zeamays:ZMA242980、ZMA242981)的同源性高于其他植物。推导的苎麻CCoAOMT酶蛋白氨基酸序列与杨树(Populusbalsamifera:AJ224894、AJ224896)、美洲山杨(Populustremuloides:PTU27116)的同源性高于其他植物。结论苎麻CCoAOMT基因cDNA与其它植物的相应序列具有同源性。

苎麻CCoAOMT基因干扰表达载体构建及对烟草的转化

根据已克隆的苎麻CCoAOMT(咖啡酰辅酶-A-氧甲基转移酶)基因cDNA序列,以其编码纤维素合成酶底物结合和催化合成结构域的cDNA序列为目标,采用PCR扩增方法引入克隆的酶切位点,分别将其正、反方向克隆到植物RNA干扰表达质粒PFGC5941T-DNA上CHSA内含子两侧,构建了植物表达苎麻CCoAOMT基因的干扰重组Ti载体.将该载体转入根癌农杆菌LBA4404后,采用农杆菌介导法对木质素研究的模式烟草WS38进行了遗传转化,抗性筛选和分子检测表明,成功获得了转基因植株.转基因植株生长延缓,表明可能存在基因表达干扰现象.

象草CpCCoAOMT2基因的克隆及生物信息学分析

从象草中克隆了CpCCoAOMT2基因,并对其进行了初步的生物信息学分析。利用转录组测序获得的表达序列信息,设计1对特异性的PCR引物,应用RT-PCR技术从象草中扩增出CpCCoAOMT2基因。对获得的基因进行序列同源性搜索、结构域搜索及3D结构预测、分子系统进化树构建等生物信息学分析。测序结果表明,CCoAOMT2基因全长926 bp,含110 bp的5'-UTR、741 bp的CDS和75 bp的3'-UTR,共编码246个氨基酸,Gen Bank登录号为Bank It1975804;Blastn和Blast T分析结果显示,CpCCoAOMT2基因及其编码的蛋白在核苷酸水平和氨基酸水平上与多种植物的CCoAOMT基因和CCoAOMT蛋白具同源性;预测CpCCoAOMT2蛋白相对分子质量为27 253,等电点为5.08,是一个不含跨膜结构域、不含信号肽分子的亲水性、稳定蛋白。分子进化树分析结果表明,CpCCoAOMT2蛋白与禾本科植物的CCoAOMT蛋白亲缘关系最近,与裸子植物和蕨类植物关系较近,而与双子叶植物的关系较远。

紫花苜蓿CCoAOMT基因家族的鉴定、进化及表达分析

紫花苜蓿是全世界广泛栽培的优质牧草。木质素与紫花苜蓿抗性密切相关,但木质素难以被牲畜消化,严重影响了紫花苜蓿的营养价值,所以培育低木质素的紫花苜蓿具有重要意义。咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素合成途径中的关键酶,本研究利用生物信息学方法对紫花苜蓿基因组中的CCoAOMT基因家族成员进行鉴定,并对其基因结构、染色体定位、系统发育、基因表达等方面进行了研究。结果表明,在紫花苜蓿基因组中共鉴定到44个MsCCoAOMT基因,其中36个(82%)MsCCoAOMT基因都含有5个外显子,分布于16条染色体上,存在明显的串联重复现象;通过系统发育树分析,MsCCoAOMT基因家族可分为5类;通过MEME软件对MsCCoAOMT蛋白motif进行预测发现了10个比较保守的motif。qRT-PCR表达分析表明部分MsCCoAOMT基因的表达具有组织特异性。研究结果对紫花苜蓿低木质素遗传改良具有潜在的理论指导意义和实际参考价值。

五节芒CCoAOMT和4CL的克隆和表达分析

木质素是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育和抵御病原微生物的侵害方面发挥着重要的作用,但木质素结构稳定,成为生物质能源转化的障碍。以五节芒(Miscanthus floridulus)为材料克隆得到了木质素合成过程中的关键酶CCoAOMT基因全长CDS序列和4CL基因的CDS半长序列,并对其CDS和氨基酸序列与其他物种进行了比对分析。相应的qRT-PCR分析显示,2个基因在五节芒的幼苗期、抽穗期的茎节、成熟叶片、幼穗都有表达,且与木质素的合成有一定的相关性。间苯三酚溶液染色结果亦显示,2个基因的表达规律与茎秆的木质化进程一致。五节芒CCoAOMT和4CL基因的克隆和表达分析将为进一步研究其生物学功能和改良能源作物奠定基础。