咪唑啉1型受体与其候选蛋白的研究进展

咪唑啉1型受体(imidazoline1receptor,I1R)是近年发现的一类新型受体,咪唑啉受体抗体选择性蛋白(imidazolinereceptorantiseraselectedprotein,IRAS)是人工克隆的I1R候选蛋白。该文从I1R和IRAS的特征、分布、生物学功能、信号转导机制等方面近年来的一些研究进展加以阐述,同时对二者的异同点进行比较和分析。

Graves病患者的促甲状腺素受体抗体与甲状腺刺激性免疫球蛋白及甲巯咪唑治疗反应的相关性

目的:评估Graves病(Graves’disease,GD)患者促甲状腺激素受体抗体(thyrotropin receptor antibody,TRAb)与甲状腺刺激性免疫球蛋白(thyroid-stimulating immunoglobulin,TSI)水平之间的相关性,比较TRAb和TSI对甲巯咪唑治疗反应的临床预测能力。方法:收集2020年1月至2021年12月在江苏省中西医结合医院就诊的患者2 145例。使用Pearson分析方法对游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)、TRAb、TSI进行相关性分析。从2 145名患者中选取50名接受甲巯咪唑治疗的GD患者并进行随访。收集患者基线资料,甲巯咪唑治疗期间患者甲状腺自身抗体水平及甲巯咪唑剂量变化(Δ_(甲巯咪唑))等。使用logistic回归分析确定与甲巯咪唑治疗快速反应性相关的预测因子。结果:GD患者的TRAb与TSI水平极强相关(P<0.001)。甲巯咪唑≥10 mg/d治疗的GD患者中FT4、TRAb、Δ_(甲巯咪唑)与治疗反应显著相关(均P<0.05),TSI无统计学意义;甲巯咪唑<10 mg/d治疗的GD患者中各指标均与治疗反应无关(均P>0.05)。受试者工作特征(receiver operating characteristics,ROC)曲线显示FT4水平是GD患者对甲巯咪唑治疗快速反应的最佳预测因子。结论:GD患者的TRAb水平与TSI水平密切相关。与TRAb相比,TSI对甲巯咪唑的治疗反应性可能更弱。

咪唑啉受体候选蛋白（IRAS）剪接体的确证与功能研究

咪唑啉受体（Imidazoline Receptor，IR）是一种新型受体，I1R亚型在体内具有重要的生理作用，如血压调节，胰岛素分泌等，其内源性配体胍丁胺在阿片依赖中的作用也逐渐受到重视。Piletz通过两种IR蛋白抗血清从人脑海马cDNA文库中克隆了5131bp的新基因（GenBank：AF082516），将其命名为眯唑啉受体候选蛋白（IRAS）。HumanIRAS与I1R具有相同的选择性配体IRAS mRNA组织分布及蛋白分布与I1R一致，越来越多的证据表明IRAS就是I1R。针对human IRAS的N端制备了小鼠单克隆抗体。通过对多种不同来源细胞系进行分析，通过Western blot方法，发现在PCI2细胞上，IRAS抗体可以特异性识别50—60KD大小蛋白，随后钓取并克隆了该基因Ratiso—Iras，编码472个氨基酸。Ratiso—Iras的克隆提示可能在人也存在相同的IRAS的剪接体。通过对Ratiso—Iras的研究，分析Rat iso—Iras与human IRAS在分布与功能的方面的差异，可以更好的阐明human IRAS的特点。目前研究已从大鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑组织均检测到Ratiso—Iras的表达，细胞定位研究表明Ratiso—Iras主要弥散分布于胞浆，human IRAS分布于胞浆并呈点簇状分布，提示两者可能存在亚细胞定位的不同，提示功能存在差别。

咪唑啉2受体配体对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠行为学及基质金属蛋白酶-9的影响

目的观察咪唑啉2受体配体(2BFI)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的行为、病理和脑脊髓中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响。方法用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)免疫C57BL/6小鼠制作EAE模型,将小鼠随机分为5组:药物干预组(EAE+2BFI 5 mg·kg^(-1)组、EAE+2BFI 10 mg·kg^(-1)组、EAE+2BFI 20 mg·kg^(-1)组)、阳性对照组(EAE+NS组)、正常对照组(完全福氏佐剂+NS组),观察比较各组行为学和病理组织学的变化,通过RT-PCR技术测定大脑和脊髓MMP-9 mRNA水平,并用免疫组化方法观测2BFI对大脑组织MMP-9阳性表达的影响。结果与EAE+NS组比,2BFI 10、20 mg·kg^(-1)药物干预组的最高行为学评分和病理变化均有减轻;而且三种不同剂量2BFI干预组大脑和脊髓组织MMP-9mRNA水平和大脑组织中MMP-9阳性表达均较EAE+NS组明显降低。结论 2BFI对EAE有保护作用,可能与其调节抑制MMP-9,保护血脑屏障,减少炎症细胞通过血脑屏障有关。

血清促甲状腺激素受体抗体和甲状腺球蛋白抗体与甲状腺功能亢进患者经碘131联合甲巯咪唑治疗后发生甲状腺功能减退的相关性

目的探讨血清促甲状腺激素受体抗体(TRAb)、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)与甲状腺功能亢进患者经碘131联合甲巯咪唑治疗后发生甲状腺功能减退的相关性。方法选取2018年2月至2020年5月天津市第二医院收治的105例甲状腺功能亢进患者作为研究对象,所有患者均行碘131联合甲巯咪唑治疗,停药后定期复诊,统计甲状腺功能减退的发生情况,并设计一般资料调查问卷,且于治疗前测定患者的实验室指标[血清TRAb、TGAb、促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT 3)、游离甲状腺素(FT_(4))]水平,分析血清TRAb、TGAb与甲状腺功能亢进患者经碘131联合甲巯咪唑治疗后发生甲状腺功能减退的相关性。结果经碘131联合甲巯咪唑治疗后,105例患者中有10例发生甲状腺功能减退(发生组),95例未发生甲状腺功能减退(未发生组);发生组血清TRAb及TGAb水平均高于未发生组,差异有统计学意义(P<0.05);两组性别、年龄、体质量、甲状腺质量、甲状腺功能亢进病程、24 h摄碘率及血清FT_(4)、FT_(3)、TSH水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);经多因素Logistic回归分析结果显示,血清TRAb、TGAb与甲状腺功能亢进患者经碘131联合甲巯咪唑治疗后甲状腺功能减退的发生有关,血清TRAb及TGAb水平升高是引发甲状腺功能减退的风险因素(OR>1,P<0.05)。结论血清TRAb、TGAb与甲状腺功能亢进患者经碘131联合甲巯咪唑治疗后甲状腺功能减退的发生密切相关。

咪唑啉受体及其对阿片药理作用的调节机制

用稳定转染咪唑啉1型受体(I1R)的细胞(CHO-I1),对I1R信号转导途径进行了初步研究。首次直接证实I1R的信号转导途径与活化PC-PLC继而产生DAG,其后引起丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)酶促级联反应过程有关。采用共同稳定表达μ阿片受体(MOR)和I1R的CHO细胞表达系统(CHO-μ/I1细胞),对I1R在受体后水平抑制吗啡依赖的可能分子机制进行了研究。首次提供了胍丁胺通过作用于I1R而抑制吗啡依赖的直接实验证据,其分子机制可能主要是胍丁胺激活I1R抑制吗啡慢性处理时cAMP通路和Ca2+信号通路代偿性适应而抑制吗啡依赖的形成。

I_1咪唑啉受体对α_(2A)肾上腺素能受体表达和功能的影响

目的在细胞水平研究I_1咪唑啉受体(I_1R)对α_(2A)肾上腺素能受体(α_(2A)AR)表达及功能的影响。方法在完成小鼠I_1R基因和α_(2A)AR基因的质粒测序及酶切鉴定后,分别转染CHO细胞,采用放射性配体-受体结合实验、流式细胞分选技术进行阳性细胞单克隆筛选,建立分别稳定表达I_1R和α_(2A)AR的CHO细胞系,以及共同稳定表达I_1R与α_(2A)AR的CHO细胞系。采用放射性配体-受体结合实验确定α_(2A)AR的亲和力及表达量,用Western印迹法研究I_1R对α_(2A)AR表达量的影响和对α_(2A)AR激动剂右美托咪定刺激细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化作用的影响。结果在转染小鼠I_1R和α_(2A)AR基因质粒后,CHO细胞生长正常。在为稳定表达小鼠α_(2A)AR的CHO细胞膜蛋白所做的放射性配体饱和实验中,3H-RX821002的Kd和Bmax值分别为(0.96±0.24)nmol/L和(0.29±0.03)nmol/g蛋白。在稳定表达小鼠I_1R的CHO细胞以及稳定表达小鼠α_(2A)AR的CHO细胞中再分别转染I_1R基因后,I_1R蛋白表达水平均明显上升(P<0.05,P<0.01)。在共同稳定转染I_1R和α_(2A)AR的CHO细胞系中,I_1R的表达上调了CHO细胞中α_(2A)AR的表达水平(P<0.01),同时也进一步上调了右美托咪定激活α_(2A)AR引起的ERK磷酸化水平(P<0.01)。结论在外源表达的细胞系中,I_1R上调α_(2A)AR蛋白的表达和右美托咪定激活α_(2A)AR后的ERK磷酸化水平。本研究为后续分子水平深入探索I_1R和α_(2A)AR之间的相互作用奠定了基础。

咪唑啉受体抗血清选择性蛋白的表达、纯化及单克隆抗体制备

目的:表达和纯化咪唑啉受体抗血清选择性蛋白(imidazoline receptor antiserum-selected protein,IRAS pro-tein),制备IRAS蛋白的单克隆抗体。方法:采用基因重组技术在大肠杆菌表达IRAS蛋白;金属镍螯合的Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以间接ELISA方法筛选分泌特异性IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞;采用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体的特异性。结果:成功表达并纯化了IRAS重组蛋白,纯度达到95%。共筛选出5株分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了IRAS的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体效价分别为1∶8×106,1∶2×106和1∶5×106,属于IgG1亚型。该抗体能与原核及真核系统表达的IRAS重组蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光显示IRAS蛋白主要定位于细胞质中。结论:建立了稳定分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,成功制备了特异性好的IRAS单克隆抗体,为研究IRAS的功能提供了有力的研究工具。

咪唑啉Ⅰ型受体候选蛋白——非G蛋白偶联受体信号转导与ERK相关

目的:研究在咪唑啉Ⅰ型受体(imidazoline-1receptor,I1R)激动剂莫索尼定和利美尼定作用下,I1R抗体选择性蛋白(imidazolinereceptorantiseraselectedprotein,IRAS)的信号转导机制。方法:采用[35S]-GTPγS结合实验,确定IRAS是否与G蛋白相偶联;采用蛋白免疫印迹方法,研究IRAS的激活与ERK磷酸化之间的关系。结果:以稳定表达有IRAS的CHO细胞(CHO-IRAS)为实验对象研究发现,利美尼定、莫索尼定在多种实验条件下均不能提高[35S]-GTPγS结合量,表明IRAS不与G蛋白偶联,而利美尼定和莫索尼定在激活IRAS的同时,能够浓度依赖性地显著升高ERK磷酸水平,其刺激作用能被I1R拮抗剂依法克生完全拮抗。结论:IRAS不与G蛋白偶联,ERK可能是IRAS偶联的信号分子之一。

PBR蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

将含有外周苯并二嗪受体(peripheral benzodiazepine receptor,PBR)蛋白基因插入片段的pQB5质粒转化大肠杆菌,并获表达。表达蛋白经金属离子螯合亲和层析和SDS-PAGE回收纯化,得PBR蛋白质纯品,为PBR特异抗体的制备及研究PBR在植物细胞中的作用提供了必要的条件。

甲巯咪唑联合糖皮质激素在甲亢患者中的治疗效果及对TPO-Ab、TGAb、TRAb的影响

目的:探讨甲硫咪唑联合糖皮质激素在甲亢患者中的治疗效果及对甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)、抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)及促甲状腺激素受体抗体(TRAb)的影响。方法:选择2018年3月-2019年1月本院甲亢患者120例作为研究对象,采用抽签法分为对照组和观察组,各60例。对照组采用甲硫咪唑治疗,观察组在对照组基础上联合糖皮质激素治疗,两组均完成6个月治疗并完成6个月随访。比较两组甲状腺、内分泌功能、TPO-Ab、TGAb及TRAb水平、药物安全性、复发率。结果:观察组治疗后6个月FT_(3)、FT_(4)、ANP、TT_(3)和TT_(4)水平均低于对照组(P<0.05);观察组治疗后6个月TPO-Ab、TGAb及TRAb水平低于对照组(P<0.05);两组治疗过程中体重增加、白细胞减少、皮疹发生率及治疗后1、3个月复发率无统计意义(P>0.05);观察组治疗后6个月复发率低于对照组(P<0.05)。结论:甲硫咪唑联合糖皮质激素能改善甲亢患者甲状腺、内分泌功能,能降低TPO-Ab、TGAb及TRAb水平,未增加不良反应发生率,能降低治疗后复发率,值得推广应用。

经不同咪唑啉类药物长期处理后大鼠脑内I_2R密度及胶质纤维酸性蛋白的变化

目的:观察咪唑啉类药物长期处理后大脑组织中咪唑啉2受体(I_2R)密度和亲和力的变化以及对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法:将大鼠随机分成生理盐水组、胍丁胺组、育亨宾组、咪唑克生组、左旋咪唑组及2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-BFI)组,腹腔注射×2周。采用放射性配体结合试验检测大脑和脑干匀浆中I_2R B_(max)和K_d变化,免疫组化测定小脑和颈髓中GFAP的表达。结果:反映I_2R密度的B_(max)值,咪唑克生、2-BFI和左旋咪唑组较NS组分别上调了80%、93%和122%(均P<0.01)。反映受体亲和力的K_d值,各组间无明显差异。咪唑克生、2-BFI和左旋咪唑组中GFAP表达比生理盐水组明显增加(均P<0.01)。结论:咪唑克生、2-BFI和左旋咪唑表现为拮抗剂特性;I_2R可能参与调节GFAP表达。

可乐定对严重烫伤大鼠心肌Giα表达的影响

目的 探讨可乐定对严重体表烫伤大鼠心肌抑制性G蛋白α亚基 (Giα)表达的作用及机制。方法 通过建立大鼠背部 3 0 %体表面积Ⅲ度烫伤模型 ,分别采用间接酶法、Westernblot测定了烫伤大鼠早期心肌AC活性、Giα水平。结果 可乐定 0 3、1、3mg kg ,可剂量依赖性地抑制烫伤后心肌Giα的增加。可乐定 0 .3～ 3mg kg还可显著升高烫伤后心肌AC基础活性 ,而 1～ 3mg kg可明显升高心肌Gpp (NH)p刺激活性 ,0 .3mg kg对心肌Gpp (NH)p刺激活性无明显影响 ;I1咪唑啉受体阻断剂efaroxan( 5、10mg kg)可部分逆转可乐定抑制烫伤大鼠心肌Giα升高的作用。结论 可乐定可抑制烫伤后心肌Giα的升高 ,其机制可能与可乐定激动I1

咪唑克生对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠MCP-1、MIP-1α表达的影响

目的:探讨不同剂量咪唑克生(Ida)对Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中枢神经系统(CNS)内单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)表达的影响。方法:以豚鼠脊髓匀浆加完全福氏佐剂免疫Wistar大鼠,建立EAE模型。观察Ida0.5、1.5和4.5mg·kg-1剂量组对大鼠的EAE发病率、神经功能缺损评分的影响,应用苏木精-伊红和Kluver & Barrera髓鞘染色方法观察大鼠CNS病理变化,采用免疫组织化学技术检测大鼠CNS内MCP-1、MIP-1α表达的变化。结果:Ida1.5和4.5mg·kg-1组的EAE发病率和神经功能缺损评分均明显降低,Ida3个不同剂量Ida干预组的CNS内MCP-1、MIP-1α的表达呈现不同程度地减少。结论:不同剂量的Ida能改善EAE,以1.5和4.5mg·kg-1组的效果更显著。推测可能与咪唑啉2受体有关。

GravesGraves病治疗前后血清甲状腺相关抗体的改变

Graves病（Graves＇disease,GD）是临床上最常见的甲状腺自身免疫性疾病,以血中升高的促甲状腺素受体抗体（thyroid-stimulating hormone receptor antibody,TRAb）为主要的免疫学标志。但临床中不乏GD患者甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody,TGAb）及甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody,TPOAb）阳性的情况。本研究主要观察初发GD患者,治疗12个月前后3个甲状腺相关抗体的情况,现报告如下。