1株与创伤弧菌培养特性相似的哈氏弧菌的鉴定

目的对一株编号为sznj2009的菌株进行分析鉴定。方法从水产品中分离到菌株sznj2009,并对该菌株的菌落形态、生化特征及生物学特性进行分析鉴定。结果该菌株在弧菌显色平板上呈圆形、光滑、较小的无色菌落;在纤维二糖粘杆菌素(Cellobiose-Colistin,CC)琼脂平板和m CPC平板上为圆形、扁平,中心不透明但边缘透明的黄色菌落;在3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上为圆形、乳白色菌落。经16S rDNA序列分析发现,该菌株与哈氏弧菌(ATCC33843)的进化距离近、同源性高,相似度为100%。结论分离于水产品中的菌株sznj2009为哈氏弧菌。在创伤弧菌传统的生化鉴定检测工作中,通过比较,发现哈氏弧菌在菌落特征和生化特性上与创伤弧菌相似,但两菌株在弧菌显色平板和生化反应上可明显区分开来,可提高创伤弧菌的鉴定准确度,同时为哈氏弧菌传统分离鉴定检测工作提供参考和借鉴。

苦参抗水产病原哈氏弧菌活性物质的提取、鉴定及作用机制

利用单因素实验、Box-Behnken试验设计结合响应面分析法,从提取溶剂(蒸馏水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇)、乙醇浓度(60%~100%)、提取温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)、提取时间(60 min、90 min、120 min、150 min、180 min)和液料比等对抑菌活性的影响几方面优化苦参抗水产病原哈氏弧菌(Vibrio harveyi)活性物质(ASSF)的提取工艺;采用高效液相色谱和标准品比对技术,鉴定ASSF的抗菌活性化合物;从对哈氏弧菌的生长、细胞膜的完整性和通透性、细胞壁的通透性等方面探讨ASSF的作用机理。结果表明:ASSF的最佳提取条件是:无水乙醇为溶剂,液料比30∶1 mL/g,提取温度79℃,提取146 min。在此条件下,提取物抑菌圈的实际值为(17.64±0.22)mm,与预测值无显著性差异。固态ASSF的得率为(21.17±0.91)%。鉴定出苦参酮是ASSF中的抗哈氏弧菌活性化合物。ASSF和苦参酮的最小抑菌浓度分别为0.125 mg/mL和0.0625 mg/mL。ASSF对于哈维氏弧菌的抑制作用主要是通过破坏细胞膜的完整性和通透性、细胞壁的通透性抑制细胞的增殖。本研究结果可为进一步开发苦参酮在水产病害防治中的应用提供依据。

大黄素-香豆素噻唑类衍生物的合成及其抗哈氏弧菌活性

以大黄素为先导化合物,根据活性基团拼接原理,将具有良好抗菌活性的香豆素噻唑和大黄素通过酰胺键连接到同一分子上,设计并合成了6个含有香豆素噻唑的大黄素酰胺类衍生物(8a~8f),并对其抗菌活性进行了评价。结果表明:化合物8b、8c和8f对哈氏弧菌活性存在不同程度的抑制作用,抑菌圈分别为13.37±0.07 mm、13.60±0.12 mm和13.54±0.09 mm,MIC均为0.25 mg/mL。所有化合物的结构经IR、1H NMR以及HR-MS(ESI)确证。

哈氏弧菌文蛤分离株WG1702培养条件优化研究

于2007年9月在江苏吕泗文蛤发病高峰期,从发病文蛤体内和养殖水体中分离到1株哈氏弧菌WG1702,培养条件优化试验结果表明,菌株WG1702在32 h时达到生长高峰,最适温度为28℃,最佳初始pH为7,最佳盐度为40,最佳装液量为60 ml/150 ml,促进生长的金属离子是NH4+、Fe2+、Fe3+,最佳C、N源为葡萄糖和蛋白胨;pH、温度、不同菌龄正交试验证明最佳组合为pH 7.11,温度28℃,菌龄24 h,通过方差分析结果可以看出三因素中pH对生长影响显著(P<0.05)。

长鳍真鲨源哈氏弧菌的主要生物学性状研究

从两尾病死的观赏用长鳍真鲨Oceanic whitetip shark,Carcharhinus longimanus L.中分离到的细菌,进行了形态特征、理化特性和对抗菌类药物的敏感性等生物学性状检验。同时,测定了16SrRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发育树。结果表明,8株供试纯培养菌(编号:HQ050226-1至HQ050226-4、HQ050227-1至HQ050227-4)为弧菌属(Vibrio Pacini 1854)的哈氏弧菌(Vibrio harveyi Johnson and Shunk 1936)。所扩增的16SrRNA基因序列长度(不包括引物结合区),HQ050226-1株为1463bp(GenBank登录号:EF635305)、HQ050227-1株为1464bp(GenBank登录号:EF635306),与GenBank数据库中哈氏弧菌的同源性在98%及99%。药敏试验结果显示,对供试37种抗菌药物中的青霉素G等4种耐药,对头孢唑啉等33种敏感。

病原哈氏弧菌对20种中草药的敏感性测定及分析

采用琼脂平板扩散法（打孔法），测定了大黄、板蓝根、苏木、金银花等20种中草药对哈氏弧菌的药物敏感性，结果发现五倍子、艾草、苏木、大黄、地锦草等12种中草药能有效抑制哈氏弧菌的生长，而石菖蒲、黄芪、金钱草和土茯苓等8种中草药对哈氏弧菌的抑菌作用较小；同时，采用试管2倍稀释法进行了大黄、穿心莲、黄芩、石韦、苏木等10种中草药对哈氏弧菌的抑菌作用，结果表明10种中草药对哈氏弧菌都具有抑菌作用，最小抑菌浓度在2．0—250g/L之间，其中五倍子的抑菌效果最好，对哈氏弧菌的MIC小于2．0g／L；桑叶和金银花的抑菌效果最差，对哈氏弧菌的MIC为500g/L。

矛尾复鰕虎鱼病原哈氏弧菌的鉴定及特异性检测方法的建立

取体表出血、肌肉溃疡的虾蟹养殖塘混养大量死亡的矛尾复鰕虎鱼的深层溃烂组织及肝脏进行细菌分离,2种被检组织中均分离到2种优势生长菌落;人工感染试验表明,其中的一株分离菌(S090801)浓度为106～108 cfu/ml可引起矛尾复鰕虎鱼全部死亡,该菌的形态特征、生理生化特性及基于16SrRNA和gyrB 2种基因的系统发育学分析确定为弧菌属的哈氏弧菌。同时基于gyrB基因序列设计1对特异性引物,建立了一种哈氏弧菌快速、敏感的PCR检测方法,扩增目的片段大小为363bp,该方法检测哈氏弧菌模板DNA最低质量浓度为0.046875ng/μl,可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。

基于toxR基因病原哈氏弧菌PCR检测方法的建立

基于toxR基因序列设计检测哈氏弧菌的1对特异性引物,通过PCR反应条件优化、PCR反应特异性及敏感性检测,建立一种哈氏弧菌的特异性分子检测方法。试验结果表明,该引物可使哈氏弧菌扩增出大小为390 bp的toxR基因片段,3种水产动物病原弧菌未扩增出任何条带,敏感性检测结果为该PCR反应最低能检测出0.375 ng/μl的哈氏弧菌基因组DNA。该试验建立的基于toxR基因的哈氏弧菌的PCR检测方法可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及海产品安全检测。

中国对虾糠虾幼体病原哈氏弧菌的鉴定及毒力基因检测

2011年春季对江苏连云港某对虾育苗场中国对虾Fenneropenaeus chinensis病死糠虾幼体分离到优势生长菌,对分离菌进行致病性、形态与生理生化特征及16S rRNA和gyrB基因同源性与系统发育分析。结果显示,引起糠虾幼体大量死亡的病原为哈氏弧菌Vibrio harveyi,菌株kx1对中国对虾仔虾和日本对虾仔虾的半数致死量LD50分别为2.0×106CFU/ml和7.0×105CFU/ml。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,进行了分离鉴定的4株病原菌对群体效应调节基因(luxR)、毒力调控基因(toxR)、溶血素基因(vhhA和vhhB)、金属蛋白酶基因(vhpA和vhpB)、毒力相关基因(toxS)、鞭毛结构基因(flaA)及锌金属蛋白酶基因(pap6)共9种毒力基因的检测,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA、vhhB和pap6毒力基因,扩增片段大小分别为679、390、1324、216和355 bp,其他4种毒力基因未检测到。分离鉴定的4株病原哈氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈氏弧菌的生物学标记。

哈氏弧菌胞外产物对红鳍东方鲀的致病性

采用平板玻璃纸覆盖技术提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)H-06091菌株的胞外产物(ECP),通过肌肉和腹腔注射2种方式研究其对红鳍东方鲀(Fugu obscurus)的致病性。采用双层纸片法对其主要酶成份进行初步研究;测定其对绵羊红细胞和红鳍东方鲀红细胞的溶血活性;将哈氏弧菌在不同温度下(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)培养36h和25℃下培养不同时间(12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h)后提取其胞外产物并对其蛋白质含量进行测定;经SDS-PAGE分离粗提胞外产物中蛋白成分,并用Dot-ELISA和Western-blot方法对其成分进行分析。实验结果显示,该胞外产物对红鳍东方鲀具有致病性;具有淀粉酶和酪蛋白酶活性,不具有卵磷脂酶、脂肪酶和明胶酶活性;对红鳍东方鲀红细胞有溶血活性,对绵羊红细胞无溶血活性;胞外产物蛋白质总含量在35℃培养36h后出现高值,与温度变化无明显相关性;25℃下培养24h、36h和48h的粗提胞外产物经SDS-PAGE分离,有3条蛋白质条带最明显,分子量分别约为31kD、38kD、60kD;其中分子量约为60kD蛋白条带,经Dot-ELISA和Western-blot方法证实其为半胱氨酸蛋白酶-1。根据以上结果认为哈氏弧菌H-06091菌株胞外产物含有多种毒力因子,与该菌的致病性密切相关。

哈氏弧菌外膜蛋白与溶藻弧菌脂多糖偶联疫苗的效果研究

采用十二烷基肌氨酸钠法提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)SpGY020601株的外膜蛋白(OMPC),采用酚水法提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)EpGS021001株的脂多糖(LPS)。通过碳化二亚铵(EDC)介导的缩合反应,将哈氏弧菌的OMPC与溶藻弧菌的LPS偶联。OMPC-LPS偶联物、未偶联的哈氏弧菌OMPC、溶藻弧菌LPS、哈氏弧菌OMPC和溶藻弧菌LPS的简单混合物以及生理盐水按相同程序免疫卵形鲳(Trachinotus cvatus)。检测血清溶菌酶活性、血清抗体微量凝集反应结果显示,卵型鲳经OMPC-LPS偶联物、OMPC、LPS以及二者的简单混合物免疫后,各免疫组间血清溶菌酶活性没有显著差异(P>0.05),但均显著高于生理盐水对照组(P<0.05);OMPC-LPS偶联物免疫组的血清抗溶藻弧菌EpGS021001抗体效价较单纯溶藻弧菌LPS免疫组、简单混合物免疫组出现得早,抗体滴度高;与此类似,OMPC-LPS偶联组中抗哈氏弧菌SpGY020601的血清抗体效价较单纯哈氏弧菌OMPC组、简单混合组出现得早,抗体滴度高,且持续时间长;对EpGS021001、SpGY020601的攻击,OMPC-LPS偶联物免疫组的保护率分别为85%和95%,高于单纯溶藻弧菌LPS免疫组的70%、单纯哈氏弧菌OMPC免疫组的75%,也高于简单混合物免疫组的80%和82.5%。

抗哈氏弧菌中草药筛选及其活性成份提取工艺的优化

为给中草药在水产病害防控中的应用提供科学依据,采用琼脂扩散法筛选出具有抗哈氏弧菌活性的中草药———鸡血藤,优化了其抗哈氏弧菌活性成分的提取工艺。首先筛选提取溶剂乙醇的最适体积分数,然后采用单因素法初步优化了提取液料比、浸润时间、温度和提取时间,之后采用Box-behnken试验设计结合响应面分析法进一步优化,最优提取条件为液料比5.00mL∶0.0744g,浸润66min,温度98.5℃,提取180min,抗哈氏弧菌活性成分提取得率的预测极值为17.043%,在最优条件下,4次平行验证,抗哈氏弧菌活性成分提取得率为(17.086±0.027)%,为优化前的1.71倍,验证值与预测值间相对误差为0.3%,模型预测准确可靠。对鸡血藤在水产病害防控中开发应用具有重要意义。

哈氏弧菌特异性检测方法的建立和应用

针对哈氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计了一对引物,从分离自患病长鳍真鲨体内的哈氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp大小的基因片段。进行了PCR方法的特异性和敏感性以及海产品检测试验,建立了一种检测致病性弧菌的PCR检测方法。结果表明,该法只检测出致病性哈氏弧菌。同时对不同浓度的细菌悬液扩增,结果显示,此方法对哈氏弧菌菌体DNA的最低检测量为0.139ng/μL,可以为哈氏弧菌的检测提供参考依据。

创伤弧菌和哈氏弧菌双重PCR检测方法的建立及初步应用

根据创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的溶细胞毒素基因序列和哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的toxR基因序列,分别设计并合成两对特异性引物,通过PCR反应条件优化,测试两种菌的特异性和敏感性,建立双重PCR方法,同时快速检测V.vulnificus和V.harveyi。结果表明:纯培养V.vulnificus和V.harveyi的检测灵敏度分别是12 cfu/mL和18 cfu/mL,与无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌及美人发光杆菌无交叉反应;此PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性,具快速、高效等优点,对细菌V.vulnificus和V.harveyi诊断与防治具有较好的临床应用性。

连云港市赣榆县水产养殖环境中哈氏弧菌耐药性研究

为了了解连云港市赣榆县水产养殖环境中哈氏弧菌的耐药性,从3个典型的水产养殖区采集样品进行菌种筛选、药敏检测及耐药基因研究。实验共筛选耐氨苄青霉素菌66株,经生理生化及PCR鉴定得到17株哈氏弧菌。药敏实验显示全部哈氏弧菌均具有多重耐药性,至少对3种以上的抗生素产生明显抗性,对头孢类抗生素耐药率高,对喹诺酮及酰胺醇类抗生素较为敏感。被检测的全部哈氏弧菌均携带TEM型β-内酰胺酶。

二种佐剂对哈氏弧菌OMPC-溶藻弧菌LPS偶联疫苗的增效作用

制备哈氏弧菌SpGY020601外膜蛋白复合物(OMPC)和溶藻弧菌EpGS021001脂多糖(LPS)偶联疫苗,设置偶联疫苗组、偶联疫苗+ISA763佐剂组、偶联疫苗+β-葡聚糖佐剂(DEAE)组以及生理盐水对照组,并以相同程序免疫卵型鲳鲹。溶菌酶活性检测、微量凝集反应试验结果显示:各疫苗组血清中的溶菌酶含量无显著差异(P>0.05),但均远高于生理盐水对照组(P<0.05);ISA763佐剂组抗哈氏弧菌SpGY020601抗体滴度较其他组出现的早,抗溶藻弧菌EpGS021001抗体滴度较其他组持续时间长;β-葡聚糖佐剂组次之,其次是无佐剂组,对照组始终未检测到抗体。各组分为腹腔注射攻毒与浸泡攻毒,对EpGS021001的攻击,ISA763佐剂组相对保护率分别为90%和70%,高于β-葡聚糖佐剂组的85%和55%,以及无佐剂组的80%和55%;对SpGY020601的攻击,ISA763佐剂组相对保护率分别为95%和80%,高于或相当于β-葡聚糖佐剂组的95%和75%,以及无佐剂组的90%和75%。

哈氏弧菌EcGY020401优化培养

目的:为规模化制备弧菌疫苗提供相关数据。方法:利用摇瓶和小型发酵罐培养,通过平板计数测定培养菌液的活菌数。结果:哈氏弧菌(Vibrio harveyi)EcGY020401株最适盐度为20～25g/L,合适的pH为7.5～7.7,葡萄糖浓度最适浓度为2～5g/L,用TSB优化培养基:胰蛋白胨5g/L、蛋白胨15g/L、大豆蛋白胨3g/L、酵母膏1g/L、葡萄糖4g/L、磷酸氢二钾5g/L、氯化钠15g/L、pH7.5,培养EcGY020401菌株,可达2.95×1010cfu/mL;小型发酵罐培养,10h可达到生长最大值,菌液浓度为3.46×1010cfu/mL。结论:用优化TSB培养基,采用发酵罐培养弧菌,可降低成本,提搞培养效率。

水产动物哈氏弧菌病及其防治方法

哈氏弧菌又称哈维氏弧菌，也有的将其记作夏威夷弧菌；以前曾由Johnson等将其命名为哈氏贝内克氏菌，1981年Baumann等将其正式归于弧菌属并命名为哈氏弧菌。该菌是一种具有发光特性的弧菌，足海水微生物区系的正常成员，也是海水中一种常见的致病菌，主要引起虾及鱼类的感染发病。本文简要介绍了该菌及其所致水产动物，疾病情况与防治方法。

哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用SDS-PAGE分析表达情况和表达条件。SDS-PAGE电泳获得分子量约为68.9 k D融合蛋白条带。在E.coli BL21(DE3)中重组质粒p ET-GR的表达条件为28℃,0.7 mmol/L的IPTG浓度诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达。哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。

大黄和公丁香对致病性哈氏弧菌及其生物膜的体外抑制作用

[目的]观察大黄(Rheum officinale)和公丁香(Flos caryophylli)对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)及其生物膜(Biofilm)的体外抑制作用。[方法]采用琼脂扩散法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌的体外抑菌作用;采用倍比稀释法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);采用MTT法评价2种中草药液对哈氏弧菌生物膜形成的影响。[结果]大黄对哈氏弧菌的抑菌圈直径为(15.31±0.4)mm,MIC和MBC均为7.813 mg/ml;公丁香对哈氏弧菌的抑菌圈直径为(11.53±0.6)mm,MIC和MBC分别为15.625和62.5 mg/ml;2种中草药液浓度分别在7.81和0.97 mg/ml以上时对生物膜的形成有极显著抑制作用(P<0.01)。[结论]大黄和公丁香对哈氏弧菌及其生物膜均有明显抑制作用,其中大黄的作用比公丁香更强。