两株珍珠龙趸病原性哈维弧菌(Vibrio harveyi)的分离与鉴定

自海南陵水和广东深圳养殖场患病珍珠龙趸(pearl gentian)分离到2株优势菌(X12XC30和X13SZ03),经回归感染实验证实2株菌是珍珠龙趸的病原菌,对珍珠龙趸的半致死浓度(LD50)分别是6.58×106 CFU·g-1和9.83×105 CFU·g-1。对菌株进行形态、颜色和生长条件等常规生理生化实验,并进行16S r DNA,rct B和tox R等管家基因的序列分析综合鉴定。结果显示:2株病原菌均为短杆状革兰氏阴性菌,TCBS生长为黄色,对O/129(150 ug·片-1)敏感,生理生化指标与哈维弧菌标准株一致;16S r DNA,rct B和tox R序列在Genbank上检索与哈维弧菌的同源性最高,根据管家基因的序列构建系统进化树,自然地与哈维弧菌分支聚类为一支,确定这2株菌均为哈维弧菌。药敏实验发现2株哈维弧菌均耐呋喃唑酮,而对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和氯霉素等药物敏感。哈维弧菌具有较高的致死率,在珍珠龙趸养殖业中存在潜在的威胁。

不同条件下哈维氏弧菌(Vibrio harvey)对墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)致病性研究

为研究墨吉明对虾弧菌病的防控方法,本文通过人工注射感染的方式,研究不同数量哈维氏弧菌及在不同温度、盐度、pH、不同硝酸氮、亚硝酸氮和氨氮浓度条件下哈维氏弧菌对墨吉明对虾的致病性的影响。结果表明：当人工感染哈维氏弧菌数量为3.16×10^8 CFU时,24 h内对虾累计死亡率为96.67%;哈维氏弧菌数量为3.16×10^6 CFU以上,实验结束时,对虾累计死亡率都超过了50.00%。在20—32℃范围内,随着温度升高哈维氏弧菌致病力增强,并且低温组（20℃实验组与26℃实验组）对虾累计死亡率显著低于高温组（32℃实验组）（P〈0.05）。在温度为（24±1）℃时,盐度为20时对虾累计死亡率处于较低水平;在温度为（24±1）℃,盐度为（22±1）时,96 h,pH为8.0时对虾累计死亡率最低,并且与另外两个实验组差异显著（P〈0.05）;温度为（24±1）℃,盐度为（22±1）,硝酸氮对感染哈维氏弧菌的墨吉明对虾有胁迫作用;在亚硝酸氮浓度（1.0—10.0 mg/L）、氨氮浓度（0.5—1.5 mg/L）范围内,哈维氏弧菌对墨吉明对虾的致病性,随着浓度升高而增强。本实验为墨吉明对虾弧菌病的防控提供了理论基础。

非可培养状态哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)复苏后生理特征及毒力相关基因表达

将哈维氏弧菌SF1接种在自然海水中低温诱导进入活的非可培养状态,用添加营养物质后升温培养的方法进行复苏。用透射电镜观察不同状态哈维氏弧菌细胞形态和结构,研究哈维氏弧菌复苏后对不良环境的抵抗力,用RT-PCR检测丝氨酸蛋白酶基因Ser和rpoS基因的表达。结果表明,进入VBNC状态的哈维氏弧菌由杆状变为球状,体积比正常细胞小,复苏后恢复正常形态且对紫外辐射,热激的抵抗能力没有明显改变,对高渗透压的抵抗力减弱,而对冷激的抵抗力增强。复苏后的哈维氏弧菌对抗生素的敏感性没有改变。用RT-PCR未检测到在VBNC状态时Ser和rpoS基因的表达,而在复苏后的细胞均检测到该基因的表达,可能是其保持致病性的重要原因之一。

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ML01株胞外产物及分泌性蛋白的分离与特性分析

本研究以引起珍珠龙胆石斑鱼[Epinephelus fuscoguttatus(♀)?Epinephelus lanceolatus(♂)]幼鱼"皮肤溃疡病"的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ML01株为研究对象,采用平板膜覆盖技术和柱层析技术,分离、纯化了ML01株的胞外产物及分泌性蛋白。应用毒性试验、质谱分析与分子克隆技术,对纯化的胞外产物和3种主要的分泌性蛋白进行了特性分析与鉴定。结果显示,哈维氏弧菌ML01株的胞外产物(Extracellular products,ECPs)具有酯酶、明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶活性,无脲酶活性。ECPs对羊红细胞无溶血性,对斑马鱼(Danio rerio)的半数致死剂量(LD50)为19.55μg/g鱼体重。从ML01株中分离到3种主要的分泌蛋白P42、P36、P31,其分子量分别为42、36、31 k Da。经质谱鉴定和分析,这3种蛋白分别为哈维氏弧菌的外膜蛋白Omp U和Omp N,以及一种功能未知的蛋白。利用同源克隆,成功地从ML01株基因组中扩增到了P42、P36、P31的基因。序列测定和比对结果显示,ML01株的这3个基因与哈维氏弧菌ATCC 33843(Gen Bank CP009467)的相应基因相比,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列的相似性分别为97.08%、100%、99.67%,其编码的多肽序列的相似性分别为99.71%、100%和99.93%。本研究对进一步分析哈维氏弧菌ML01株的致病机理、研发该菌的亚单位疫苗具有重要的参考价值。

豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌遗传参数分析

哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)是引起豹纹鳃棘鲈(Plectropomusleopardus)患“烂身病”的主要致病菌,每年6―8月发病率极高,严重影响了该品种养殖业的可持续发展。因此,培育抗病良种是豹纹鳃棘鲈养殖业的迫切需求。为评估豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌遗传参数,本研究基于高密度单核苷酸多态性位点构建的基因组亲缘关系矩阵,使用4种模型(BLM、BTM、LLM和LTM)拟合了2种抗病表型(测试日性状,TDS;二元死亡存活性状,TS),并用约束最大似然法(REML)估算方差组分。经分析,豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌遗传力为0.182~0.486,属中高遗传力性状,加性遗传方差为0.071~0.262。其中,利用线性模型(BLM和LLM)估算的遗传力分别为0.382和0.476,利用阈值模型(BTM和LTM)估算的遗传力分别为0.182和0.207。表明可以通过遗传选育提高豹纹鳃棘鲈抗弧菌能力。对不同模型估算的基因组估算育种值(GEBV)进行相关性分析,不同模型拟合同种抗病表型时,GEBV之间相关系数> 0.9,属于高强度正相关关系,表明使用同种表型定义时,阈值或线性模型对GEBV排名影响很小。对不同模型估算的GEBV与不同表型进行相关性分析的结果显示,纵向模型(LLM和LTM)估算的GEBV与表型TS之间的相关系数高于横截面模型(BLM和BTM),说明表型TDS可能比表型TS更适合作为抗病表型。此外,在线性模型中,使用表型TDS和表型TS估算的GEBV之间的相关系数<0.85,说明采用2种表型定义下估计的豹纹鳃棘鲈抗哈维弧菌GEBV排名不一致。但基于表型TDS估算的GEBV与表型TS之间的相关系数较强(0.824),表明使用表型TDS和纵向模型(LLM)估算豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌遗传参数更有优势。本研究补充了豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌遗传参数研究,为豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌良种选育提供了参考。

拮抗哈维氏弧菌的黄姑鱼肠道原籍益生菌的体外筛选

试验旨在筛选对哈维氏弧菌具有防治作用的益生菌。试验通过比较红头病和健康黄姑鱼肠道微生物差异,进一步通过体外抑菌试验、药敏试验、生物安全性试验,筛选出对红头病病原哈维氏弧菌B0003具有拮抗作用且对宿主安全的肠道益生菌候选菌株。结果显示,红头病和健康黄姑鱼肠道微生物存在较大差异,选择12株候选菌株测试其对哈维氏弧菌B0003的拮抗作用。体外抑菌试验发现,5株候选菌对哈维氏弧菌B0003具有明显抑制作用,其抑菌能力由强到弱依次为:暹罗芽孢杆菌B0E14、贝莱斯芽孢杆菌DM5、巨大芽孢杆菌B1M2、枯草芽孢杆菌B0E9、粪肠球菌AT5。这5株拮抗菌均不具有溶血活性,且不会对黄姑鱼健康造成不利影响,对大多数抗菌药物敏感。研究表明,试验筛选的5株候选菌具有作为益生菌用于黄姑鱼红头病防治的潜力。

一株牙鲆源哈维氏弧菌的分离鉴定及抗性研究

自秦皇岛昌黎养殖的患病牙鲆(Paralichthys olivaceus)体内分离获得一株革兰氏阴性菌,对其形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列进行分析,鉴定其为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi);对分离菌株进行了30种抗菌药的药敏试验和11株益生菌的拮抗试验,得出此分离菌株对米诺环素、左氧氟沙星、头孢他啶、氟苯尼考、头孢曲松、诺氟沙星、环丙沙星、强力霉素、复方新诺明等13种药物高度敏感,对克林霉素、青霉素、氨苄西林、林可霉素、苯唑西林等9种药物表现为不同程度的耐药性;地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌2种益生菌在一定浓度下对其具有拮抗作用。

抗哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血性弧菌三联卵黄抗体的制备及体外作用效果评估

为研究三联特异性卵黄抗体对哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血性弧菌的体外抑菌效果,通过制备哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血性弧菌三联灭活疫苗,免疫蛋鸡。收集鸡蛋制备卵黄抗体并检测其效价、纯度和特异性。通过免疫荧光、扫描电镜和体外抑菌实验初步探究其制备的三联特异性卵黄抗体对3种弧菌的体外抑菌效果。结果显示,ELISA检测特异性卵黄抗体效价高达1∶51200,并维持5周;SDS-PAGE对分离纯化的卵黄抗体分析显示,随着纯化步骤的进行,卵黄抗体中的蛋白杂带逐渐减少,纯度变高。免疫荧光和免疫印迹实验表明,特异性卵黄抗体与抗原的结合具有较高的特异性。扫描电镜进一步观察发现,相比非特异性卵黄抗体,特异性卵黄抗体处理过的弧菌,菌体互相黏附在一起,菌体细胞表面粗糙,细胞壁破损。在体外抑菌实验中,特异性卵黄抗体对弧菌具有明显的抑制效果,且抑制作用呈现剂量依赖性。研究表明,三联特异性卵黄抗体能够与哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌发生特异性结合,通过体外实验发现,卵黄抗体通过凝集和黏附,破坏菌体细胞的完整性,从而发挥抑菌作用。实验结果为研发绿色、安全、高效的抗哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌三联特异性卵黄抗体提供理论和实验基础。

病原哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)TS-628菌株基因组分析

哈维氏弧菌是海洋鱼类和无脊椎动物的重要条件致病菌,经常造成海水养殖动物严重病害,给水产养殖业造成巨大的经济损失,而不同来源的哈维氏弧菌的毒力存在很大差异。本研究采用第二代Illumina Hiseq平台与第三代PacBio平台相结合的测序技术,对分离自福建海域患病青石斑鱼的哈维氏弧菌TS-628菌株进行基因组测序和分析,挖掘该菌的基因组信息,从基因组层面了解该病原菌的毒力相关基因,以期为哈维氏弧菌后续致病机制的研究以及哈维氏弧菌病防治提供有力数据支撑。结果表明,哈维氏弧菌TS-628菌株基因组含2条染色体、2个质粒,其中1个质粒为新发现质粒;基因组大小为6151198 bp,基因组GC含量为44.68%,共编码5658个基因,共预测到毒力基因747个,毒力基因主要与细菌的黏附、摄铁系统及分泌系统有关;此外,还发现耐药基因294个,反映该菌株不仅具有编码多种毒力因子的潜力,同时具有抗多种药物的可能。

水产品中哈维氏弧菌分子生物学检测方法研究进展

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是水产品中常见的食源性病原菌。该文从其生物学特性出发,对哈维氏弧菌的致病性及分子生物学检测方法,包括微流控芯片、传感技术及核酸适配体、蛋白质谱等多种检测方法的最新研究进展进行综述,为提高水产品中哈维氏弧菌检出率,为食源性疾病的预防和检测工作提供参考和借鉴。

黄唇鱼致病性哈维氏弧菌的分离与鉴定

2023年3—5月,广东省惠州市一方海(广东)海洋牧场有限公司所繁育的黄唇鱼(Bahaba taipingensis)出现发病和死亡的现象,症状主要为食欲下降,凸眼,尾鳍和背鳍出现出血,且腹腔有腹水,内脏部位附近出现充血,此外其他部位均正常,无其他明显病症。为确定其病因,采集死亡病鱼的心脏、脾脏、肝脏、头肾、中肾等组织样品,通过对分离纯化的优势菌株的形态特征、16S rRNA基因序列进行综合分析,大部分组织样品均发现哈维氏弧菌,由此初步确定此次引发黄唇鱼死亡的菌株为哈维氏弧菌。

中草药对大菱鲆源哈维氏弧菌的体外抑菌效果

为了解中草药对大菱鲆源哈维氏弧菌的体外抑菌效果,采用琼脂扩散法和二倍稀释法测定了哈维氏弧菌菌株对18种中草药的敏感性。结果显示:五倍子、石榴皮、大黄、乌梅和苏木的抑菌作用最强,最小抑菌浓度(MIC)<12.5 mg/m L;黄连、马齿苋、鱼腥草、穿心莲、公丁香和桉树叶的抑菌作用次之,MIC为12.5~25mg/m L;沙棘、黄柏、辣蓼、甘草和薄荷抑菌效果较好,最小抑菌浓度(MIC)为100~500 mg/m L;而陈皮、石菖蒲的抑菌作用不明显,MIC均大于500 mg/m L。结果表明,18种中草药中五倍子、石榴皮、大黄、乌梅和苏木对大菱鲆源哈维氏弧菌有较好的抑菌效果,可为防治大菱鲆哈维氏弧菌病中草药制剂的开发提供参考。

花鲈弧菌病病原菌(哈维氏弧菌)的分离与鉴定

1999年 4～ 5月 ,山东省青岛市胶南海区网箱养鱼场花鲈 (Lateolabraxjaponicus)幼鱼发生暴发性传染病 ,死亡率达 5 0 %。从具有明显症状的病鱼的病灶组织分离到 1株优势菌SF 1,经人工感染和从人工感染发病的花鲈再分离的SF 3菌株的再感染试验结果表明 ,所分离的菌株为此次花鲈烂尾病的致病菌。经形态、生理生化等 64项特征指标鉴定 ,SF 1和SF 3均为哈维氏弧菌 (Vibrioharveyi)。药敏试验结果表明 ,头孢噻肟、头孢三嗪、头孢孟多、呋喃妥因、氯霉素、氧哌嗪青霉素、磺胺类、复方磺胺、三甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素E等

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK真核表达载体构建及在毕赤酵母中的表达

采用已构建的原核重组质粒pET30a-OmpK为模板,通过PCR扩增OmpK成熟肽基因片段,引入酶切位点后克隆至分泌表达载体pPIC9K,经SalⅠ线性化后,氯化锂法转化至毕赤酵母GS115中,并经G418遗传霉素筛选高拷贝酵母转化子,最后进行甲醇诱导表达,表达上清经SDS-PAGE电泳检测及Western-blot鉴定,表明重组蛋白已经表达。

养殖石斑鱼溃疡病病原哈维氏弧菌胞外产物的研究

以网箱养殖的患溃疡病青石斑鱼（Epinephlus awoara）和斜带石斑鱼（Epinephlus coioides）分离的哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）TS-628菌株为研究对象，采用平板玻璃纸覆盖技术，获得该菌株的胞外产物（ECP），并对其成分进行分析。利用杯碟法研究表明，哈维氏弧菌TS-628菌株的胞外产物具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、卵磷脂酶等多种酶活性和溶血活性，且溶血性物质具有热不稳定性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及考马斯亮蓝R-250染色分析表明，ECP蛋白条带主要集中在分子质量范围25．0～66．2ku之间，经不同时间培养所获得的ECP在凝胶上显示出的蛋白条带几乎一致。采用复性电泳方法（G-PAGE）分析了哈维氏弧菌及其它4种弧菌属细菌的ECP蛋白酶活性，结果发现哈维氏弧菌ECP在酸性条件下，蛋白酶活性较强，在碱性条件下，蛋白酶带明显减少，活性很弱。在相同的pH条件下，5种弧菌中以副溶血弧菌的ECP蛋白酶活性最强，种类多，分子质量范围宽；而哈维氏弧菌的蛋白酶带较少，活性也稍弱。

大黄鱼感染哈维氏弧菌后血液生化指标的变化及组织病理学观察

从患病大黄鱼病灶中分离出病原哈维氏弧菌,并人工回接感染大黄鱼,病鱼出现典型的皮肤溃疡症。测定大黄鱼血液各项指标发现,病鱼单核细胞、嗜中性粒细胞、血栓细胞百分率明显下降,而淋巴细胞百分率增加,均呈极显著差异(P<0.01)。患病大黄鱼总蛋白为(12.8±3.95)g/L,对照组鱼为(19.4±4.33)g/L,病鱼球蛋白、甘油三脂、血糖含量也明显低于对照组(P<0.01)。然而病鱼谷丙转氨酶为(37±5.11)IU/L,对照组为(28±5.54)IU/L;病鱼谷草转氨酶为(164±47.19)IU/L,对照组为(117±21.84)IU/L,均呈极显著差异(P<0.01)。研究结果说明,病鱼肝脏和肾脏组织受损。对患病大黄鱼进行病理组织学观察,结果发现病鱼病变组织头肾、肝出现不同程度的变性以及坏死。细胞超微病变观察发现,头肾肾小管上皮细胞变性、坏死。肝细胞胞浆内脂滴积累多。血清指标的测定可以作为大黄鱼哈维氏弧菌病细菌感染的指标。

斜带石斑鱼病原菌(哈维氏弧菌)的分离与鉴定

从患病斜带石斑鱼 (Epinepheluscoioides)肝脏组织分离到EcGY0 2 0 4 0 1菌株 ,经人工感染、回归感染实验证实为致病菌。通过API系统和菌体常规形态特征、培养特性和生理生化反应指标测定以及 16SrRNA测序分析等综合鉴定 ,Ec GY0 2 0 4 0 1菌株为弧菌属哈维氏弧菌 (Vibrioharveyi) ,其半致死剂量LD50 为 2 .7× 10 6CFU/g鱼体重。药敏试验结果表明 ,EcGY0 2 0 4 0 1菌株对利福平、四环素。

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表达

根据哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEMTeasy载体,测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因。用PCR方法去除其信号肽序列,定向克隆到原核表达载体pGEX4T2构建重组表达质粒pGEX4TOmpK。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GSTOmpK融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Westernblotting分析表明,它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应,提示外膜蛋白OmpK可能是哈维氏弧菌的重要保护性抗原之一。

2012年～2014年南海海水养殖鱼类病原菌哈维弧菌分离株的耐药性分析

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖鱼类主要的病原菌,给养殖业带来了巨大的损失。该研究采用K-B法对南海地区沿岸养殖鱼类90株哈维弧菌分离株进行抗生素耐药性分析,通过系统聚类法以平方Euclidean距离来分析菌株间的耐药性同类关系,探讨哈维弧菌耐药性的时空分布和耐药谱的多样性。结果显示,90株哈维弧菌共有耐药谱26种,谱型丰富度为28.9%。其中,多重耐药谱(耐3类及以上抗生素)21种,包含菌株共35株,占总菌株数的38.9%,谱型丰富度为80.8%。从时间分布上看,2012年、2013年和2014年分别具有10、18和8种耐药谱型;从地区分布上看,海南、广东和广西3个地区分别包含17、13和2种耐药谱型,时间与地区的耐药谱型差异明显。90株哈维弧菌样本聚类分析得到GroupⅠ、GroupⅡ和其他组群,分别含有11、12和4种耐药谱,耐药谱型率分别为16.9%、57.1%和100%,而GroupⅠ和GroupⅡ组群进而分为5个亚群i^v。结果表明,在广东、海南和广西地区养殖鱼类中所分离到的哈维弧菌耐药谱具有复杂多样性特征,随着时间年份的递增,哈维弧菌耐药谱种类也发生着更新变化,耐药谱不断扩大延伸。

致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测

从山东沿海的发病鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到1株致病性哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1．4kb的特异性片段。DNA序列分析表明，该克隆片段含有完整的1254bp溶血素基因，该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99．0％和98．5％；与副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）热稳定性溶血素基因（TDH）的相似性为74．5％；与拟态弧菌（V．mimicus）、创伤弧菌（V．vulnificus）、霍乱弧菌（V．chderae）磷脂酶基因的序列相似性分别为57．4％、59．2％、53．0％；与最小弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、霍氏弧菌（V．hollisae）、河流弧菌（V．tguvialis）、鳗弧菌（V．anguillarum）的溶血素基因的相似性仅为19．9％～24．8％。根据溶血素基因的保守区段，设计了1对特异引物。分析表明，该引物能特异检测哈维氏弧菌。其可检测的DNA最小量为0．001ng。用该方法对55株不同来源的患病鱼分离的疑似病原菌进行检测，结果检出8株哈维氏弧菌，检出率为14．55％，从健康动物中检出数占所检弧菌数的6．25％，海洋环境为10．53％，海水养殖环境为26．53％，表明哈维氏弧菌在不同的海水环境及健康海洋动物中普遍存在，在养殖水体中的数量高于其他海水环境。