玉米茎腐病生防菌哈茨木霉CCTH-2鉴定及其生物学特性

玉米茎腐病(CSR)对玉米产量和品质危害巨大。为尽快展开玉米茎腐病的有效防治,将吉林省玉米茎腐病的优势致病菌禾谷镰孢,与14株从玉米根际土壤中分离得到木霉菌株分别进行平板对峙试验。观察木霉对禾谷镰孢的抑制作用,筛选得到抑制效果较好的菌株CCTH-2和CCTH-6。复筛通过这2株木霉的发酵液、易挥发性代谢产物、难挥发性代谢产物对禾谷镰孢的抑制效果和对其他病原真菌的抑制效果,最终筛选到一株具有良好防效的木霉菌株CCTH-2;CCTH-2经过形态学和分子生物学鉴定显示,为哈茨木霉,并对其生物学特性进行初步研究。结果表明,平板对峙培养条件下CCTH-2对禾谷镰孢抑制率为82.83%,其发酵液、易挥发代谢物和难挥发代谢物对禾谷镰孢的抑制率为36.56%,46.75%,32.48%,具有显著抑制效果。生物学特性试验显示,CCTH-2菌落生长和产孢的最适培养基为PDA,最适温度为25℃,最适光照条件为全光照,外源添加Fe^(2+)有利于CCTH-2的生长发育,并且CCTH-2具有一定的适应环境酸碱度和盐含量变化的能力。因此,可以确认哈茨木霉CCTH-2是一株有着良好防效且潜力巨大的生防菌。

不同培养条件对长枝木霉SMF2和哈茨木霉T39生长与产孢的影响

采用十字交叉法和血球计数法分析不同培养基、温度、光照、酸碱度、碳源和氮源等对长枝木霉SMF2和哈茨木霉T39菌丝生长和孢子形成的影响,明确两种木霉生长繁殖的最佳条件,指导其人工扩繁和工厂化生产。结果表明,SMF2和T39在含碳源和有机氮的PDA、CDA培养基中,常温、黑暗、非强酸强碱培养条件下其菌丝生长良好,光照、果糖、牛肉膏培养条件更有利于二者孢子形成;温度、酸碱度和培养基是影响SMF2和T39孢子形成的主要因素,35℃、pH值为7、PDA培养基最利于SMF2产孢,30℃、pH值为6、CDA培养基最利于T39产孢;相同条件下,SMF2的菌丝生长略快,而T39的产孢能力更强;单糖和有机氮更有利于促进SMF2和T39产孢。

哈茨木霉T_2菌株耐药性的测定及其对几种病原菌的抑制作用研究

[目的]为提高木霉菌的生物防治效果。[方法]研究了哈茨木霉T2菌株对3种病原真菌(齐整小核菌、立枯丝核菌和香蕉枯萎病菌)的抑制作用,分析其对7种杀菌剂的耐药性,并探讨了哈茨木霉T2菌株与杀菌剂联用对立枯丝核菌和齐整小核菌的抑制作用。[结果]哈茨木霉T2菌株对病原真菌的抑制随处理时间的延长而增强。处理后120 h其对齐整小核菌、立枯丝核菌、香蕉枯萎病菌的抑制率最高,分别为63.10%、65.64%和33.84%。哈茨木霉T2菌株对多菌灵的耐药性最强,EC50为4 345.32 mg/L。在浓度为800 mg/L时多菌灵对哈茨木霉T2菌株的抑制率为13.73%,当浓度在50 mg/L以下时抑菌率几乎为0。哈茨木霉T2菌株对代森锰锌、露星较敏感。[结论]哈茨木霉T2菌株与甲霜灵联用,能明显抑制齐整小核菌、立枯丝核菌的生长。

哈茨木霉LTR-2对椒样薄荷耐盐生理特性的影响

木霉菌(Trichoderma spp.)是一类能够刺激作物生长并增强其抵抗生物和非生物胁迫能力的多功能益生真菌,目前国内外对于生防木霉菌在增强植物耐盐性及其作用机理方面尚缺乏深入、系统的研究。本文研究了生防木霉菌LTR-2对椒样薄荷耐盐生理特性的影响,结果显示,在200 mmol/L NaCl胁迫下,LTR-2有效缓解了盐胁迫对椒样薄荷的生长和光合的抑制。探讨了LTR-2接种的椒样薄荷耐受NaCl胁迫的生理生化基础,结果表明,LTR-2提高了椒样薄荷的抗氧化活力,减少了活性氧积累;增强了细胞膜和液泡膜H+-ATPase以及Na+/H+逆向转运蛋白等离子转运通道的活性,从而调节盐分的吸收和分布。这些结果为椒样薄荷在盐碱地区的引种及木霉菌剂的开发应用提供了实验依据。

哈茨木霉LTR-2双价基因重组菌株的构建及其防治效果

本文利用限制性内切酶介导法转化哈茨木霉LTR-2,获得具有双价基因(glu14、chi42)的重组生防菌株。试验得到的木霉转化子具有遗传稳定性,于无药PDA平板上连续转接6次后,在Hyg 200μg/m L的PDA平板上仍可继续生长。PCR扩增及Southern杂交证实目的基因已随机插入木霉基因组DNA上,本试验转化子均为单拷贝插入。转化子的β-1,4-葡聚糖酶和几丁质酶水解活性较出发菌株LTR-2显著提高(P<0.01),其中转化子L-15的两种水解酶活性均最高。转化子在温室条件下对番茄晚疫病、茄子猝倒病和黄瓜灰霉病均有较好的防治作用,但不同处理间存在显著性差异(P<0.01),其中转化子L-15最高,对3种病害的防治效果分别达到了91.5%、94.9%和83.8%,较出发菌株LTR-2处理分别提高了53.5%、55.9%和33.5%。结果表明,利用REMI技术,将β-1,4-葡聚糖酶基因glu14和几丁质酶基因chi42重组到木霉染色体DNA上,是获得高效重组菌株的有效手段。

哈茨木霉LTR-2对冬小麦籽粒的影响

为了探明生防木霉菌剂LTR-2对冬小麦籽粒的影响,同时提供一种提高小麦品质的实践方法,以济麦44为试验材料,在孕穗期喷施不同浓度木霉菌剂LTR-2,对小麦籽粒千粒重、蛋白质、氨基酸和湿面筋含量进行测定与分析。结果表明,在小麦孕穗期喷施不同浓度的木霉菌剂,小麦籽粒千粒重、蛋白质、氨基酸和湿面筋含量均较对照有提高,孕穗期喷施木霉菌剂有助于提高产量以及小麦籽粒营养品质和加工品质。

哈茨木霉重组株L-15与野生株LTR-2贮存稳定性及生防活性研究

为比较哈茨木霉重组株L-15与野生株LTR-2在贮存稳定性及生防活性方面的差异,采用平板菌落计数法检测木霉可湿性粉剂中分生孢子的存活率,测定菌株的生物学特性,并在温室条件下评价制剂对番茄立枯病的防治效果。结果表明,分生孢子存活率达80.0%时,在5℃和室温(2℃~36℃)下,L-15可湿性粉剂的货架期分别为24个月和9个月,显著高于LTR-2可湿性粉剂的12个月和6个月。L-15的潮霉素抗性在贮存后稳定遗传,其β-1,4-葡聚糖酶水解活性、几丁质酶水解活性及平板拮抗活性较LTR-2明显提高。5℃贮存60月后,L-15可湿性粉剂10×和100×稀释处理对番茄立枯病的温室防治效果分别达89.27%和86.52%,与LTR-2处理间存在极显著性差异(P<0.01)。重组株L-15的货架期和生防活性较野生株LTR-2明显提高,在生物防治领域具有潜在应用价值。

哈茨木霉T2-16突变体库的构建及突变株表型分析

为了优化高效拮抗生防菌哈茨木霉T2-16的EMS诱变条件,构建哈茨木霉T2-16突变体库,为哈茨木霉功能基因组研究奠定材料基础,以哈茨木霉T2-16为试验材料,采用单因素试验以0~0.6 mol·L-1 EMS溶液分别处理不同浓度孢子0~6 h,明确适于哈茨木霉诱变的EMS最佳浓度、处理时间和孢子浓度。以最适参数诱变处理野生型菌株,进行生长势、拮抗能力和生防效果比较。结果显示,0.4 mol·L-1 EMS溶液处理浓度为106·mL-1的孢子4 h,其致死率接近70%,诱变效果最佳。经生长势、拮抗能力和生防效果比较发现,生长势呈正向突变占有率达46.20%,其中,16株突变菌株拮抗作用明显增强,T42和T62的生防效果分别高出野生型菌株31.64%和27.91%,为研究哈茨木霉与生防相关的功能基因打下基础。

拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件优化

【目的】优化拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件,快速、高效获得绿色荧光标记菌株,为哈茨木霉及同类真菌的GFP标记提供参考,并为下一步研究其在不同环境中的定殖动态、分布规律及生防特性等打下基础。【方法】采用PEG-Ca Cl2介导的原生质体转化体系,从木霉菌株的菌龄、酶解时间、转化体系中质粒的含量及再生培养基中潮霉素B(Hm B)的浓度等方面对哈茨木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件进行优化,获得表达稳定的转化子,并与出发菌株的生长特性进行比较,评价转化效果。【结果】gz-2菌株培养36 h菌丝所形成的原生质体稳定性最好,菌丝体酶解3.5 h获得的原生质体数量最多,达11.67×106个/m L;每240μL转化体系中质粒DNA含量为40μL,得到的转化子数量最多,为8.67个/皿;再生培养基中Hm B含量为600μg/m L时可获得稳定的强转化子。【结论】筛选获得1株表达稳定的转化子GFP-gz-2菌株,该菌株在菌落形态、菌丝生长速率及产孢量上与出发菌株gz-2无显著差异,且具有较好的遗传稳定性。

哈茨木霉发酵产物对豇豆产量和品质的影响

在豇豆苗期移栽时,用哈茨木霉T2-16发酵液进行蘸根处理,在豇豆结荚后期测定了该处理对植株结荚及荚果品质的影响。结果表明,T2-16发酵液蘸根处理,能使豇豆后期功能叶片保持较高的叶绿素和蛋白质含量水平,维持较高的光合速率,从而延缓植物叶片衰老,有效地促进生殖生长,进而提高产量。此外,蘸根处理后还可提高豆荚中维生素、蛋白质、可溶性糖等的含量,改善产品的品质。

哈茨木霉发酵产物对豇豆立枯病的抗生作用

为探明木霉发酵产物对植物病害的拮抗机制,用哈茨木霉T2-16菌株发酵产物对豇豆苗期立枯病菌进行了离体抑菌、田间浸种防病试验.结果表明,该发酵产物对病原菌具有抗菌作用,使病菌菌丝原生质浓缩、外渗,菌丝体断裂、消解;经发酵液浸种处理的豇豆幼苗在人工接种立枯病菌后,叶片中过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性均增强,立枯病发病率也低于对照,对该病的防效可达75.66%.

SMF2和T39代谢产物对国槐根茎腐烂病致病镰刀菌的抑菌活性

【目的】研究长枝木霉SMF2和哈茨木霉T39的不同培养液和培养时间的代谢产物和不同有机溶剂的萃取物对镰刀菌的抑菌活性,明确SMF2和T39抑菌活性物质的培养条件和提取方法。【方法】以引起国槐根茎腐烂病的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solani)、多隔镰刀菌(F.decemcellulare)、木贼镰刀菌(F.equiseti)和F.keratoplasticum为靶标,采用菌丝生长速率法测定抑制率及毒力。【结果】SMF2和T39的PD培养液对尖孢镰刀菌的抑制作用最强;以WBM为营养基质、培养5 d的SMF2培养液,以PD营养基质、培养7 d的T39培养液,抑菌效果最优;正丁醇为SMF2和T39的抑菌活性物质的最佳提取溶剂,分步提取法正丁醇提取物对尖孢镰刀菌的抑菌效果良好,EC50仅为187.39和193.60 mg/L。【结论】SMF2和T39对镰刀菌具有较强的抑制效果;优化了木霉抑菌活性物质的营养条件和培养时间。

木霉菌对杂交水稻生长影响差异的研究

[目的]通过比较哈茨木霉(Trichoderma harzianum)抗药性标记菌株TUV-13和野生型菌株T2-16对水稻生长影响的差异,筛选出对水稻生长有更好促进作用的菌株,进一步推动木霉生防菌株在水稻上的应用。[方法]采用不同浓度的TUV-13和T2-16孢子悬浮液对水稻进行人工接种(浸种处理),确定最适浸种浓度;室外盆栽试验采用常规方法测定水稻各个生长势指标。[结果]确定TUV-13和T2-16最适浸种浓度均为1×105个/ml;用此浓度的孢子悬浮液浸种均能提高种子活力,且TUV-13对水稻萌发的促进作用更显著,幼苗鲜重比经T2-16浸种处理增加4.85%,活力指数提高5.96%。盆栽试验显示,2个处理均能促进水稻植株根系和地上部分的生长,经TUV-13孢子悬浮液浸种的效果最显著。[结论]TUV-13对T优6135的生长具有更显著的促进作用,显示出TUV-13在水稻应用上的巨大潜力。

木霉对草酸耐受和消除作用的初步分析

【目的】草酸(Oxalic acid,OA)是灰霉菌(Botrytis cinerea)等植物致病菌的致病因子,一些木霉(Trichoderma spp.)生防菌可消除草酸并降低植物发病率,但其消除草酸防治病害的途径和机制尚未研究透彻。【方法】首先从42株木霉菌株中筛选出一株在30 mmol/L草酸胁迫下耐受性最强的哈茨木霉T.harzianum LTR-2,通过形态学方法观察和原位分析了不同浓度草酸胁迫下LTR-2的发育特征变化,并测定了草酸消除水平、滤液p H和菌丝干重,分析了LTR-2在草酸为唯一碳源的生长情况。通过Real-time PCR分析了OXDC基因LTR_4445在草酸处理下的表达水平。【结果】在PDA固体培养基中,25°C半光照条件下培养5 d,在草酸浓度为50-80 mmol/L时,LTR-2可存活,但无正常菌落形态;在30-50 mmol/L浓度下,LTR-2先萌发厚垣孢子,而后再次萌发菌丝形成菌落;在<30 mmol/L浓度下,LTR-2发育正常,仅生长速度减缓。25°C、160 r/min振荡培养5 d,LTR-2可消除草酸。在20 mmol/L浓度时,草酸消除率最高,为66.50%;10 mmol/L浓度中的消除率次之,为55.06%。草酸浓度>50 mmol/L时,消除能力下降为6.75%-38.94%。相应地,培养液p H被不同程度地提高,在10、20 mmol/L草酸浓度下提高的幅度更大。当草酸浓度<20 mmol/L时,木霉的菌丝干重有不同程度的提高。将草酸作为唯一碳源进行液体培养5 d时,在10、20 mmol/L浓度下,LTR-2可形成肉眼可见的绿色菌丝球,但高于50 mmol/L条件下无法生长。草酸处理下,LTR_4445表达水平上调。【结论】通过分析LTR-2在草酸胁迫条件下的形态特征变化及消除草酸的特性,暗示在木霉消除草酸作用中除了已知的草酸降解代谢途径,还存在响应草酸胁迫模式的转变、将草酸作为前体转化为营养物质的途径等其他消除途径。