哈蟆油抗衰老活力生物效价检测方法的研究

目的基于哈蟆油补肾益精的功效,建立以抗衰老活性为指标的哈蟆油生物效价检测方法,并以此评价不同产地哈蟆油的质量,为完善其质量标准提供参考。方法以MRC-5细胞为研究对象,H_(2)O_(2)作为急性衰老模型诱导药物,通过细胞活力、β-半乳糖苷酶染色率验证哈蟆油抗衰老作用。选择Vc作为参照物,CCK-8法作为哈蟆油生物效价测定方法,以相对增殖率为参数,计算供试品抗衰老效价。结果细胞活力检测中,与模型组相比,哈蟆油组能上调细胞活力,250.0μg·mL^(-1)效果达到最佳,上调20.01%。经哈蟆油预处理的细胞中,SA-β-gal阳性细胞的比例降低17.70%。抗衰老效价测定结果显示,不同产地哈蟆油药材抗衰老活力效价范围为218.03-1152.04 U·mg^(-1),极差为934.01 U·mg^(-1)。结论建立的哈蟆油生物效价检测方法可明显区分哈蟆油质量差异,为其质量评价和控制提供一定的参考。

哈蟆油传统功效应用与开发研究

哈蟆油为补益上品,具有“补肾益精、健脾益胃、润肺生津、养颜美容”等诸多传统功效,现代临床主要应用于“抗疲劳、抗应激、抗衰老、镇咳祛痰、促生长发育、提升免疫、治疗哮喘”等。较高的医用价值、营养价值促使其市场价格昂贵,被美誉为动物界的“软黄金”。基于哈蟆油的需求量大、价格高,市场上涌现出形形色色的哈蟆油伪品。控制哈蟆油药材质量,以传统功效为导向,对哈蟆油进行再加工、深加工,开发系列保健品、食品、化妆品等产品,既能有效拓宽哈蟆油的市场覆盖面,提升产品价值,又能提高林蛙养殖户的经济效益。本文整理了哈蟆油传统功效、化学成分和开发应用现状,为哈蟆油可持续利用与开发具有重要的指导意义。

哈蟆油酶解物激活MAPK/ERK信号凋亡途径修复皮质酮诱导HT-22细胞损伤作用

为研究哈蟆油(Oviductus Ranae,OR)对海马神经元细胞保护作用机制,该研究通过皮质酮(Corticosterone,CORT)诱导HT-22细胞损伤模型探究哈蟆油酶解物对小鼠海马神经元细胞(HT-22)细胞损伤模型的保护作用及其作用机制。采用CORT与HT-22细胞共同培养建立HT-22细胞损伤模型,给予哈蟆油酶解物再次孵育,将ERK信号通路抑制剂PD98059加入HT-22细胞中。采用MTT法、Hochest 33258染色、流式细胞术、Western blot技术检测HT-22细胞凋亡情况和相关蛋白表达以及MAPK/ERK信号通路蛋白表达。结果显示高水平CORT能够诱导HT-22细胞损伤,哈蟆油酶解物能够使CORT诱导的HT-22细胞活力提升62.5%~87.5%,凋亡比例降低50%~70%。哈蟆油酶解物能够上调BCL-2、P-ERK1/2蛋白表达,同时下调BAX、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达。上述结果表明,高水平CORT是通过抑制MAPK/ERK信号通路促进凋亡的发生从而诱导HT-22细胞损伤,哈蟆油酶解物能够通过激活MAPK/ERK信号通路调节BLC-2、BAX、Caspase-3、Caspase-9凋亡相关蛋白的表达进而抑制凋亡的发生减轻神经元损伤,该作用机制为哈蟆油发挥抗抑郁作用的关键途径之一。

哈蟆油现代研究进展及质量标志物预测分析

哈蟆油是我国吉林省道地药材,现代医学称其为“绿色软黄金”,被定为国家二级保护中药材,具有补肾益精、养阴润肺之功效,常用于病后体弱,神疲乏力,心悸失眠,盗汗,痨嗽咳血等病症的治疗。哈蟆油主要含有多糖、蛋白质、氨基酸、脂肪酸、甾体、类固醇、磷脂、核苷、维生素、矿物质元素等化学成分。本研究对哈蟆油的化学成分和药理作用进行归纳总结,同时结合质量标志物的概念理论,发现30余种可作为哈蟆油质量控制的潜在质量标志物,为进一步提升哈蟆油质量评价体系提供参考,助力哈蟆油高质量发展。

哈蟆油和哈蟆皮脂肪酸成分的比较分析

目的:比较分析哈蟆油和哈蟆皮脂防酸成分。方法:分别用不同的方法处理哈蟆油和哈蟆皮,并采用气相色谱技术对其进行分析。结果:共检出25种脂肪酸。其中7种饱和脂肪酸,11种多不饱和脂肪酸(PUFA),7种单不饱和脂肪酸。对于哈蟆皮主要以棕榈酸、棕榈烯酸、油酸、亚油酸、次亚油酸、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)为主,哈蟆油主要以棕榈酸、棕榈烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、次亚油酸、AA、EPA 为主。结论:哈蟆皮中的多不饱和脂肪酸相对含量高于哈蟆油。

HPLC法比较哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因的含量

建立高效液相色谱法测定1-甲基海因含量的方法,比较哈蟆油和哈蟆卵中其含量。色谱柱:Venusil MP-C_(18)(4.6 mm×150 mm,5μm);检测波长:215 nm;流动相:100%水;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃。结果表明,1-甲基海因在35.110 0～0.351 1μg/mL线性关系良好(r=0.999 9);哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因的平均回收率(n=6)分别为100.55%和100.87%。该方法简便、准确、重复性好,可作为哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因含量的测定方法。

哈蟆油动物基原问题探讨

目的 :根据历史文献及现代在中国林蛙分类方面研究成果 ,确定哈蟆油的正品动物基原。方法 :查阅历代本草著作及相关历史文献资料与近代国内外对中国林蛙有关研究报道 ,进行整理、分析、总结。结果 :本草著作中记载的山蛤原动物为中国林蛙 ;中国林蛙是独立的种 ,而不是欧洲林蛙的一个亚种 ;中国林蛙有 4个亚种 ,分别为中国林蛙指名、兰州、康定、长白山亚种 ;哈什蟆的原动物为中国林蛙长白山亚种。结论 :中国林蛙长白山亚种为哈蟆油正品动物基原。

中药材哈蟆油PCR鉴定的初步研究

从中国林蛙 (Ranachensinensis)、中华大蟾蜍 (Bufogargarizans)以及鳕鱼 (Gadusmacrocephalus)等组织材料中提取DNA ,扩增出约 340bp的 12SrRNA基因片段 ,测定其序列 ,并参考有关序列 ,设计一对哈蟆油的鉴别引物HsmL1、HsmH1,用该鉴别引物扩增蛙类原动物的模板DNA时 ,只有中国林蛙和黑龙江林蛙的模板能得到阳性扩增 ,其余样品为阴性 .因此该对引物能用于哈蟆油药材来源的鉴别 .对购自 5个不同药材商店的哈蟆油PCR鉴定结果表明 ,现市售商品哈蟆油有不同的材料来源 .图 3表 1参

哈蟆油胶囊对衰老模型小鼠生殖器官的保护作用

目的以D-半乳糖所致雌性衰老模型小鼠为实验对象,观察哈蟆油胶囊(OR)对其生殖器官的保护作用。方法采用雌性昆明小鼠48只,随机分为OR高、低剂量组和阳性药对照组、模型对照组,每组12只,D-半乳糖颈背部皮下注射6周。另设一组12只,同样部位每日注射生理盐水,作为正常对照组。第3周开始灌胃给药,模型对照组和正常对照组灌胃植物油。最后2周逐只进行阴道脱落细胞涂片,使用瑞氏-姬姆萨染液染色后观察其阴道角化细胞变化,计数动情期天数。给药结束后收集标本,采用放免法测定血清雌二醇水平,测定卵巢和子宫指数,观察卵巢和子宫病理变化,检测卵巢子宫中SOD以及MDA的水平。结果OR明显提高老年小鼠体内雌激素水平,延长小鼠动情期;增加其卵巢和子宫指数,改善卵巢和子宫的病理改变,降低卵巢子宫中MDA含量,提高其SOD活力。结论OR能够延缓雌性小鼠生殖衰老,增强生殖器官抗氧化作用,从而改善其萎缩和衰老程度。

哈蟆油与类似品和伪品的质量评价

目的建立哈蟆油及其类似品黑龙江林蛙油、桓仁林蛙油与伪品蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油的定性和定量方法。方法系统地研究不同产地哈蟆油及其类似品与伪品的膨胀度、薄层色谱法等定性鉴别方法,并采用高效液相色谱法、凯氏定氮法、氯胺T比色法和茚三酮柱后衍生化-氨基酸分析法等,分别测定哈蟆油及其类似品与伪品中1-甲基海因、激素、总蛋白质、胶原蛋白和氨基酸的含量。结果哈蟆油、黑龙江林蛙油及桓仁林蛙油膨胀度均大于75.0,青蛙油膨胀度范围为52.5～95.4,而蟾蜍油和牛蛙油膨胀度均低于40.0。蟾蜍油和牛蛙油薄层色谱图中有2个特征性斑点,与哈蟆油、黑龙江林蛙油、桓仁林蛙油及青蛙油的色谱图有明显区别。哈蟆油及其类似品与伪品中均检测出1-甲基海因,其含量质量分数为1.51×10-4%～3.72×10-2%。哈蟆油及其类似品与伪品中雌二醇、雌酮、睾酮和孕酮等4种激素含量为微量。哈蟆油及其类似品总蛋白质含量、氨基酸含量明显高于蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油等伪品,但胶原蛋白含量明显低于3种伪品。结论系统地研究了不同产地哈蟆油及其类似品与伪品的定性和定量分析方法,为哈蟆油质量综合评价和控制提供了详实的实验数据,对今后药典哈蟆油质量标准的修订具有重要的参考价值。

哈蟆油对D-半乳糖所致雄性衰老大鼠肝组织CyclinD1、CDK6和P15蛋白表达的影响

目的探讨哈蟆油对D-半乳糖所致雄性衰老大鼠肝组织细胞周期素D1(CyclinD1)、周期性依赖性激酶6(CDK6)和细胞周期蛋白D/CDK激酶的抑制因子P15蛋白表达调控的影响。方法 SPF级SD雄性大鼠18只,随机分为模型、维生素E(VE)和哈蟆油组,每组6只,D-半乳糖颈背部皮下连续注射6周,另取雄性大鼠6只,同样部位每日注射生理盐水,作为空白组。第3周开始灌胃给药,给药时间30d。给药结束后收集标本采用Western blotting法检测肝组织CyclinD1、CDK6和P15蛋白的表达。结果与空白组比较,模型组大鼠肝脏CyclinD1蛋白、CDK6蛋白、P15蛋白表达明显下调。雄性衰老大鼠口服哈蟆油后,CyclinD1、CDK6和P15蛋白表达量(与内参比较)分别为41.73±0.54、23.29±0.30和21.49±0.30。与模型组相比,哈蟆油组能明显上调肝脏CyclinD1、CDK6、P15蛋白的表达(P<0.01)。结论哈蟆油能不同程度上调CyclinD1和CDK6蛋白表达,促进衰老雄性大鼠肝细胞增殖。同时反馈性上调细胞增殖负性调控蛋白P15表达,防止不必要的过度增殖。哈蟆油延缓雄性衰老作用可能通过调控肝脏有关增殖蛋白表达发挥抗衰老作用,与VE作用有所不同。

RP-HPLC测定哈蟆油中1-甲基海因的含量

目的建立哈蟆油中1-甲基海因反相高效液相色谱（RP—HPLC）含量测定方法。方法采用ZORBAX Eclipse XDB—C18柱（4．6mm×150mm，5μm）色谱柱，检测波长为235nm，乙腈-水（10：90）为流动相，流速为0．3mL·min^-1。结果在0．32—1．58μg内峰面积与其浓度呈良好的线性关系（r=0．9999），方法的精密度RSD为0．8％。平均回收率为99.5％，RSD为1．3％。结论测定方法简便快捷、精密度高、准确性好，可以作为哈蟆油中1-甲基海因的测定方法，以控制其原料的质量。

HPLC测定哈蟆油中十六烷酸胆甾醇酯含量研究

目的:建立测定哈蟆油中的十六烷酸胆甾醇酯的含量方法。方法:采用ZorbaxSilica色谱柱,流动相为环己烷-乙醚(40:1);检测波长203nm;柱温40℃;流速1mL·min-1。结果:十六烷酸胆甾醇酯在0.60-8.92μg具有良好线性关系,平均回收率为98.4%,RSD1.8%,具较好的精密度及稳定性。结论:HPLC测定哈蟆油中的十六烷酸胆甾醇酯的含量,不仅操作简单、准确,而且重复性好。

哈蟆油活性部位的研究

哈蟆油活性部位的研究刘素琴，邓英杰，刘淑珍沈阳药科大学药物研究所１１０Ｏ１５蒋亚君，李淑范沈阳市延风制药厂苗林哈尔滨医科大学哈蟆油（ＯｖｉｄｕｃｔｕｓＲａｎａｅ）亦称哈土蟆油，田鸡油，为蛙科动物中国林蛙（Ｒａｎａｔｅｍｐｏｒａｒｉａｃｈｅｎｓｉｎｅｎ...

莪术、哈蟆油对去势后大鼠雌激素水平及受体表达的影响

目的检测莪术、哈蟆油对去势后大鼠血清雌激素水平、脾脏雌激素受体表达,探讨其对生殖内分泌-免疫网络的影响及作用机制。方法将成年SD雌性大鼠去势后制成更年期综合征模型,给药12周后,采用放射免疫法测定大鼠血清性激素(E2、FSH、LH、T、P)和白介素-2含量。取脾脏用免疫荧光法检测雌激素受体表达。结果与模型对照组比较大剂量莪术、哈蟆油能升高去势大鼠血清E2、T、P水平(P<0.01),明显提高IL-2含量(P<0.01),有降低FSH、LH含量趋势(P>0.05),并能显著升高脾脏ER表达水平(P<0.01)。结论莪术、哈蟆油可提高去势大鼠血清性激素水平,增强脾脏ER表达,为临床治疗更年期综合征提供实验依据。

哈蟆油的抗衰老作用

哈蟆油具有抗衰老作用属首次发现，１００ ｇ果蝇培养基中加哈蟆油分别为６８，３４ ｍｇ，均可延长果蝇平均寿命．哈蟆油喂饲 ４０天的果蝇在－５℃低温环境下的存活率较 ＮＳ组增加了 １１．９％～１６．１％，脂褐质含量下降１０．４％～ １５．５％．小白鼠灌服哈蟆油６８０， ３４０ ｍｇ·ｋｇ~－１·ｄ~－１×７，使小鼠肝、脑过氧化脂质含量下降，升高血浆ＳＯＤ的活性．

哈蟆油对D-半乳糖致衰老模型雌性大鼠的实验研究

目的观察哈蟆油(OR)对D-半乳糖所致雌性衰老模型大鼠血清和肝组织超氧化物歧化酶(SOD)及其分型铜锌-SOD(CuZn-SOD)、过氧化物酶(POD)、总抗氧化能力(T-AOC)等活性的影响。方法采用SPF级雌性SD大鼠40只,随机分为OR高、中、低剂量组和模型组,每组8只,D-半乳糖颈背部皮下注射6周。另设一组8只,同样部位每日注射生理盐水,作为正常对照组。第3周开始灌胃给药,模型对照组和正常对照组灌胃植物油。给药结束后收集标本,采用紫外分光光度法测定血清和肝组织总SOD,CuZn-SOD,POD,T-AOC的水平。结果模型组大鼠血清和肝组织总SOD、CuZn-SOD、POD和T-AOC活性明显降低,与其他各组比较有显著性差异(P<0.01)。OR高剂量组比中、低剂量组能显著提高血清中上述指标数值(P<0.05,P<0.01);OR中剂量比低剂量组能显著提高血清SOD,CuZn-SOD活性(P<0.05)。OR高剂量组比低剂量组能显著提高肝组织中上述指标(P<0.01)。结论 OR明显提高老年雌性大鼠血清和肝组织SOD、CuZn-SOD,POD和T-AOC活性。OR能够增强衰老雌性大鼠抗氧化应激水平,从而改善其衰老程度。

哈蟆油对生长及性器官的影响

哈蟆油对大黄、甘蓝大油致体虚小鼠体重减轻有明显抑制作用，而对正常小鼠体重无影响．对雌性幼年小鼠有促性成熟趋势（Ｐ＞０．０５），促进去势幼年大鼠前列腺、睾丸生长．

哈蟆油对雌性衰老大鼠子宫组织p16和cyclinD1蛋白表达的影响

目的探讨哈蟆油(OR)对D-半乳糖所致雌性衰老大鼠子宫组织细胞增殖负性调控因子p16和正性调控因子cyclinD1蛋白表达的影响,进一步探讨OR延缓雌性大鼠生殖器官衰老机制。方法 SPF级SD雌性青年大鼠40只随机分为模型组(D-gal组)、维生素E(VE组)、哈蟆油高剂量组(OR-H组)、中剂量组(OR-M)、低剂量组(OR-L组),每组8只,D-半乳糖颈背部皮下注射42 d,建立亚急性衰老模型。另取雌性青年大鼠8只,同样部位每日注射生理盐水,作为空白组。第15天开始灌胃给药,给药时间28 d。给药结束后,免疫组化法检测衰老大鼠子宫组织p16和免疫印迹法检测cyclinD1蛋白的表达情况。结果雌性衰老大鼠子宫组织免疫组化结果表明,子宫组织p16阳性染色多为胞浆着色,见于子宫内膜、上皮细胞胞浆、子宫间质腺体腺上皮细胞胞浆,外膜上皮也有表达,弥漫性、灶性分布均有。D-gal组p16阳性细胞积分与空白组比较升高(P<0.01)。OR各剂量组与D-gal组相比,p16阳性细胞积分降低,差异有显著性(P均<0.01)。免疫印迹法结果表明D-gal组子宫组织cyclinD1蛋白表达与空白组比较降低,差异有显著性(P<0.01)。OR-H、M、L组cyclin D1蛋白表达与D-gal组比较,表达均升高(P值均<0.01),OR-H组尤为明显。结论应用OR可以减缓衰老子宫组织结构的损伤,改善衰老子宫萎缩和衰老程度,OR可降低雌性衰老大鼠子宫组织细胞增殖负性调控因子p16蛋白的高表达,同时显著提高细胞增殖正性调控因子cyclinD1蛋白的表达,促进衰老雌性大鼠子宫细胞增殖。哈蟆油延缓雌性生殖器官衰老作用可能通过调控子宫p16-cyclinD1信号通路来促进有关增殖调控蛋白表达发挥延缓衰老作用。