哈蟆油蛋白酶解物氨基酸组成和安全性研究

研究哈蟆油蛋白酶解物的氨基酸组成,通过急毒试验和30 d喂养试验对其安全性进行评价。采用柱前衍生化法测定哈蟆油蛋白酶解物中的氨基酸的相对含量;急性毒性试验以动物最大耐受剂量灌胃给药,观察急性毒性反应和死亡情况;30 d喂养试验按临床给药剂量的100倍、75倍、50倍灌胃给药,观察大鼠的一般行为情况、体质量、血液学指标、血清生化指标、各脏器重量及脏器比,检查大鼠各脏器病理组织。哈蟆油蛋白酶解物氨基酸组成的结果为必需氨基酸的相对含量高达45.87%,半必需氨基酸14.78%。急毒试验结果为哈蟆油蛋白酶解物以临床剂量的127倍灌胃给药,未发现毒性反应。30 d喂养试验结果,与对照组相比,哈蟆油蛋白酶解物各剂量组大鼠一般情况、体质量、血液学指标、血清生化指标、脏器重量及脏体比、病理组织学检查均无显著性差异。综上判定哈蟆油蛋白酶解物对大鼠的生长、发育、代谢及脏器无急性不良影响,并可为机体提供大量必需氨基酸。

哈蟆油蛋白酶解物对小鼠微核、精子畸形及Ames试验的研究

目的对哈蟆油蛋白酶解物致畸毒性进行研究。方法通过小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验和Ames试验对哈蟆油蛋白酶解物进行观察研究。结果与阴性对照组相比,各剂量组小鼠的嗜多染红细胞含微核率、精子畸形率均无显著性(P<0.001),无论在加和不加S9混合液时,各剂量组均未引起试验菌株的回复突变菌落数显著增加。结论哈蟆油蛋白酶解物无毒、无致突变性。

哈蟆油蛋白酶解物对乙醇诱导的L-02细胞损伤的作用

目的:研究哈蟆油蛋白酶解物(ORPH)对乙醇诱导的L-02细胞损伤相关通路蛋白表达影响的作用机制研究。方法:复合酶解法制备ORPH,以400 mmol·L^(-1)乙醇建立L-02肝细胞损伤模型,细胞增殖与活性检测试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡、周期变化,JC-1/Hochest染色观察形态学变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路及细胞焦亡相关蛋白在L-02肝细胞中的表达变化,研究ORPH对乙醇所致肝细胞损伤的保护作用及机制。结果:CCK-8法结果表明400 mmol·L^(-1)乙醇可在12 h内明显引起L-02肝细胞损伤;与空白组比较,模型组L-02细胞活力显著下降(P<0.01),细胞处于G0/G1期的细胞占比显著升高(P<0.01),细胞总凋亡率显著升高(P<0.01),线粒体膜电位下降;B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax),细胞色素C(Cyt C),半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)凋亡相关蛋白的表达明显升高(P<0.05,P<0.01),MAPK信号通路相关蛋白c-Jun氨基末端激酶(JNK),p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)明显上调(P<0.05,P<0.01),且焦亡蛋白Caspase-1,白细胞介素-1β(IL^(-1)β)表达明显增强(P<0.05),Bcl-2显著下降(P<0.01);与模型组比较,ORPH处理组细胞周期阻滞有所改善(P<0.05,P<0.01),细胞总凋亡率显著下降(P<0.01),线粒体膜电位升高,呈剂量相关性;Bax,Cyt C,Caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),MAPK信号通路相关蛋白及焦亡相关蛋白表达均呈下降趋势(P<0.05,P<0.01)。结论:ORPH可通过抑制乙醇诱导L-02肝细胞引起的氧化应激肝细胞损伤,改善恢复线粒体膜电位,降低线粒体介导的细胞凋亡通路蛋白的表达,并抑制MAPK信号通路相关蛋白、焦亡通路相关蛋白表达,从而降低乙醇诱导L-02肝细胞的线粒体功能障碍及炎症反应并减轻氧化应激,对酒精性肝损伤起到治疗作用。