不同启动子引导的人凝血因子Ⅷ基因载体在HC11细胞和小鼠乳腺中表达的研究

目的应用山羊β-酪蛋白基因启动子（P1A3），构建真核细胞表达人凝血因子Ⅷ（humancoagu—lationfactorⅧ，hFⅧ）全长cDNA载体（pcDNA3．1．P1A3-hFⅧ）和hFⅧB区缺失（humancoagulationfactorⅧB—domain．deleted，hFVⅧBD）的cDNA载体（pcDNA3．1-P1A3-hFⅧBD），研究它们在乳腺细胞中的表达情况，同时与巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）启动子引导的相应的hFⅧ载体进行比较。方法采用常规DNA分子克隆技术构建人凝血因子Ⅷ（hFⅧ）基因载体，转染小鼠乳腺上皮细胞（HC-11），应用RT—PCR以及real—timePCR技术检测hFⅧ基因转录本；对NSL期母鼠乳腺注射DNA载体后，采集试验母鼠乳汁，应用ELISA检测乳腺细胞分泌hFⅧ蛋白的瞬时表达水平。结果应用构建的CMV启动子和P1A3启动子指导的hFⅧ基因载体转染HC-11细胞后，在mRNA水平均有表达；瞬时转染哺乳期母鼠的乳汁检测表明，转染CMV和P1A3启动子的hFⅧ载体的母鼠，乳汁中的hFⅧ蛋白表达量分别为2．81μg／ml（CMV—hFⅧBD），2．01μg/ml（CMV—hFⅧ），1．82μg／ml（P1A3-hFⅧBD），1．20μg／ml（P1A3．hFⅧ）。结论构建的乳腺特异性表达hFⅧ基因的载体，转染HC-11细胞和乳腺组织后的mRNA及蛋白表达水平均证实了该载体的有效性：CMV启动子引导的hFⅧ载体表达虽稍高于P1A3启动子载体，但由于后者具有乳腺特异表达的特点，更适用于乳腺生物反应器。我们构建hFⅧ基因的载体的经验，为乳腺生物反应器的研制提供了有价值的科学依据。