野生型ADAR1蛋白与其R916W突变体在哺乳动物细胞中相互作用的研究

目的:应用酵母双杂交和哺乳动物双杂交系统研究野生型双链RNA腺苷酸脱氨基酶ADAR1蛋白(ADAR1WT)与其突变体R916W(ADAR1R916W)之间的相互作用,从而探讨ADAR1基因错义突变在遗传性对称性色素异常症中的分子致病机制。方法:通过RT-PCR方法从患者外周血白细胞中获得含ADAR1基因R916W突变的全长cDNA,将野生型和突变cDNA分别克隆到相关质粒载体上,利用MatchmakerTMGAL4酵母双杂交系统3和CheckMateTM哺乳动物双杂交系统检测蛋白单体间的相互作用。结果:在酵母细胞中未检测到野生型-野生型ADAR1蛋白及野生型-突变体ADAR1蛋白间的相互作用;与对照细胞相比,pBIND-ADAR1WT和pACT-ADAR1WT共转染的HeLa细胞中荧光素相对活性显著升高(P<0.05);与共转染pBIND-ADAR1WT和pACT-ADAR1WT的HeLa细胞比较,pBIND-ADAR1R916W和pACT-ADAR1WT共转染的细胞中荧光素相对活性明显降低(P<0.05),为前者的66%。结论:在哺乳动物细胞中ADAR1WT自身相互作用,ADAR1WT和ADAR1R916W突变体蛋白相互作用依然存在但作用明显减弱。

丙型肝炎病毒核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在HepG2细胞中的相互作用

目的:使用哺乳动物双杂交系统探讨HCV-core与HCBP12在人肝癌细胞HepG2细胞中的相互作用.方法:PCR分别扩增含HCV core及HCBP12的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体,经测序正确后再分别克隆入哺乳动物双杂交的表达质粒PBIND和PACT中,并转染HepG2细胞,48h后检测细胞中报告基因luciferase activity的表达水平.结果:Dual-Luciferase Activety系统检测显示PBIND-core与PACT-HCBP12实验组萤火虫荧光与海肾素荧光的比值明显高于其他阴性对照组,但低于阳性对照组.结论:哺乳动物双杂交系统证实HCV核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在人肝癌细胞系中HepG2中有一定的相互作用,为进一步研究HCV-core和HCBP12的功能奠定基础.