快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库

目的快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法分离外周血淋巴细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体重链可变区(VH)和全长Kappa型轻链(LCκ)基因库,分别插入载体pDGB-HC-TM,化学转化感受态大肠杆菌DH5α,构建抗体的轻、重链基因库,然后将其联合转染CHO细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在CHO细胞表面的表达。结果构建的非特异性IgG1-Kappa抗体基因库,重链库容量达2.6×105,轻链库容量达2.0×105,理论库容量高达5.2×1010。随机从重链库和轻链库各挑选10个克隆送测序,重链10个克隆的DNA序列分析显示8个含有正确的阅读框架,轻链10个克隆的DNA序列分析显示全部含有正确的阅读框架。流式细胞仪分析显示来自轻链库的10个克隆、重链库的8个克隆均可检测到抗体在CHO细胞表面的表达。用所构建的轻重链抗体库共转染CHO细胞,流式细胞仪分析可检测到抗体在细胞表面的表达,阳性细胞比例达到31.5%,说明所构建的抗体库能够在CHO细胞表面成功展示全长抗体。结论采用本研究建立的哺乳动物细胞展示技术,可在2周内成功构建库容量大且多样性好的全人源抗体基因库,用于高亲和力特异性抗体的筛选。

应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库

目的应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库。方法采集登革确诊患者恢复期外周血,分离外周血淋巴细胞并提取其总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库;将抗体基因库转染CHO细胞、用流式细胞仪分析抗体在CHO细胞表面的表达。结果以1.2μg总RNA为模板,用6套引物扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,轻链基因库容量为1.45×104,重链基因库容量为1.8×105;随机挑选的10个轻链克隆和10个重链克隆,经过测序鉴定,轻链有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,重链有7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析含有正确阅读框架的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达,抗体库中可表达的抗体多样性达到109。结论以1.2μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建可表达库容量达到109的登革病毒特异性全长人抗体基因库。

哺乳动物细胞表面展示人源HIV特异性全长抗体库的构建

目的构建人源的HIV特异性全长抗体基因库并获得可稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库。方法提取HIV患者外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体重链可变区(VH)基因,插入哺乳动物细胞表达载体pDGB4,转化感受态大肠杆菌TOPO-10,构建抗体基因库,随后将抗体库的质粒DNA稳定转染FCHO细胞,获得可稳定展示全长抗体的细胞库,用流式细胞仪分析全长抗体在FCHO细胞表面的表达。结果本研究以少量外周血淋巴细胞RNA为来源,构建了库容量为7.77×104的全长抗体基因库;将基因库的质粒DNA稳定转染FCHO细胞后,获得了可稳定展示全长抗体的细胞库;经流式细胞仪分析,有67%的细胞表面可表达可被检测到的全长抗体。结论本研究构建了人源的HIV特异性全长抗体基因库并获得可稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库,为治疗HIV感染的特异性抗体的筛选打下了基础。

应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建动脉粥样硬化抗体库

目的:利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建动脉粥样硬化(As)抗体细胞库,以寻找动脉粥样硬化治疗性抗体。方法:将载体pcDNA5/FRT改造成双表达载体pcDNA-DHL。分离动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞,提取总RNA,逆转录为cDNA。PCR扩增抗体重链可变区和Kappa型轻链全长,连接至双表达载体pcDNA-DHL,即动脉粥样硬化抗体基因库pDHL-As,将其转染Flp-In TM-CHO细胞(FCHO),流式细胞术检测重组抗体在细胞表面的表达。加入潮霉素筛选出成功转染pDHL-As载体的细胞,即为动脉粥样硬化全长抗体细胞库。结果:成功构建双表达载体pcDNA-DHL。构建的重、轻链初库容量分别达1.79×10^5和1.80×10^5,理论上抗体库多样性为2.32×10^10。动脉粥样硬化抗体库pDHL-As可成功展示在细胞表面,并分选出45个表达抗氧化型低密度脂蛋白抗体的FCHO细胞。结论:本研究成功构建了一个动脉粥样硬化全长人源抗体细胞库。

抗戊型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :构建人抗戊型肝炎病毒 (HEV)噬菌体抗体库 ,筛选人源中和性抗HEV的单克隆抗体 (mAb)。方法 :取抗HEV抗体阳性的 6例HE患者静脉血 ,分离淋巴细胞 ,提取细胞总RNA后逆转录。用一组人IgGFab基因特异性引物 ,分别扩增IgGκ0轻链与重链Fd段基因。将κ轻链与Fd段基因先后克隆入噬菌体载体pComb3的相应位点 ,经电穿孔法转化大肠杆菌XL1 Blue ,再以辅助噬菌体VCSM13超感染 ,构建人抗HEV噬菌体抗体库。采用独特的 5轮筛选法 (逐渐降低抗原包被量 ,严格洗脱条件 ) ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原 ,筛选人噬菌体抗体库 ,并以ELISA鉴定噬菌体抗体。结果 :经数次电转化构建了容量为1.9× 10 7重组率为 80 %的κ轻链基因库 ;容量为 1.8× 10 7重组率为 2 0 %的Fab基因库。以含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异淘筛 5次 ,出现特异富集。ELISA鉴定第 5轮筛选产物 ,得到 4株与HEVORF2重组混合抗原具有较高亲和力的Fab噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。结论 :成功地构建了人抗HEV噬菌体抗体库 ,并获得人源抗HEV特异性噬菌体抗体。

鼠源E型肉毒毒素免疫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

目的：构建鼠源E型肉毒毒素（BoNT/E）免疫噬菌体单链抗体库,筛选BoNT/E特异性抗体。方法：从E型肉毒类毒素免疫小鼠的脾细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,分别扩增出小鼠重链可变区基因和轻链可变区基因;通过重叠延伸PCR将重链可变区基因和轻链可变区基因组装成scFv基因,重组于噬粒pS100中,电转化大肠杆菌TG_1,合并所有克隆成初级库;随机挑取克隆进行核苷酸序列测定,对初级库序列多样性进行分析;在辅助噬菌体M_（13）K_（07）的拯救下,构建成scFv噬菌体抗体库;用纯化的BoNT/E对鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库进行3轮富集筛选,制备单克隆的噬菌体抗体颗粒进行酶联免疫吸附试验,阳性克隆进行核苷酸序列测定。结果：鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库的库容为7.09×10^7,随机挑取的20个克隆序列各不相同,序列正确率为85%,基本覆盖了IgHV、IgKV、IgLV的优势家族;纯化的BoNT/E作为抗原通过3轮筛选,噬菌体抗体富集了66倍,第3轮筛选后随机挑取90个克隆制备噬菌体抗体颗粒,酶联免疫吸附试验分析有88个呈现阳性反应,序列比对得到了24个不同序列的BoNT/E特异性抗体。结论：构建了库容量达7.09×10^7的鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库,筛选得到了24个不同序列的BoNT/E特异性抗体。

抗人B型钠尿肽噬菌体抗体库的构建及噬菌体抗体的筛选

目的利用噬菌体表面展示技术构建抗人B型钠尿肽(BNP)的单链噬菌体抗体库及筛选抗人BNP的特异性单链噬菌体抗体。方法从正常人外周血淋巴细胞提取总RNA,扩增抗体重链和轻链可变区基因片段,加入连接子并构建单链噬菌体抗体库。用人BNP包被的免疫管筛选噬菌体。经过4轮的富集筛选,从最后一轮噬菌体感染的大肠杆菌TG1中随机挑选20个单菌落,用ELISA方法测定阳性噬菌体抗体,并将这些噬菌体抗体与BSA进行交叉反应试验。结果ELISA测试表明,20个单菌落中有8株吸光度较高而且交叉反应较弱的阳性噬菌体抗体,DNA测序符合预期目标。结论成功构建人B型钠尿肽噬菌体抗体库,并筛选出表达人源性BNP单克隆抗体噬菌体,为下一步抗BNP单链抗体的表达纯化及临床应用打下了基础。

A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库的构建

目的 构建A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库。 方法 利用全套噬菌体抗体表面展示技术 ,从A型流感病毒核蛋白免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA ,利用抗体可变区PCR混合引物进行全套抗体重、轻链基因的扩增。经重叠延伸反应 ,在体外随机装配成单链抗体。将其克隆到噬菌粒载体PCANTAB5E中 ,电转化TG1细菌 ,以辅助噬菌体M13 K0 7超感染噬菌体文库 ,构建全套ScFv抗体库。 结果 成功利用噬菌体表面展示技术 ,构建了A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,库容量达到 8 2× 10 7。 结论 构建全套A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,为利用亲和富集筛选技术 ,获得具有A型流感病毒核蛋白结合活性的完整重组噬菌体克隆奠定了基础。

系统性红斑狼疮儿童特异性全长抗体基因库的构建与分析

目的构建系统性红斑狼疮(SLE)儿童个体特异性哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法采集SLE确诊患儿外周血,分离外周血淋巴细胞,提取外周血淋巴细胞总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因、构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库,将抗体基因库转染293T细胞,流式细胞仪分析抗体在293T细胞表面的表达。结果以0.8μg总RNA为模板,用6套引物成功扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,构建获得的重链基因库容量为9.4×104,轻链基因库容量为8.4×104。随机挑选的10个重链克隆有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,10个轻链克隆7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析挑选的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在293T细胞表面的表达,理论上抗体库中可表达的抗体多样性可以达到109。结论以0.8μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建SLE儿童特异性全长人抗体基因库,并在293T细胞表面成功展示SLE儿童个体抗体库中的全长抗体,为进一步研究SLE儿童自身抗体的特点及自身抗体在SLE发病机制中的作用及临床应用打下良好基础。

真核表达系统的抗体库技术研究进展

单克隆抗体(mAb)药物研制经历了鼠源性、人鼠嵌合、人源化改造以及全人源这4个阶段,其中全人源抗体因其免疫原性最低而得到相对广泛的应用。全人源抗体的制备主要包括转基因鼠技术和抗体库技术,在抗体库技术中主要包括基于原核表达系统的噬菌体技术和基于真核表达系统的核糖体技术、酵母技术以及哺乳动物细胞技术。本文主要综述了近些年来基于真核表达系统的抗体库技术的研究发展。

C-GPC3蛋白的表达及人源GPC3抗体的筛选

目的构建C-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)基因真核表达质粒,表达C-GPC3蛋白,并通过哺乳动物展示型全人源sc Fv抗体库筛选GPC3抗体。方法通过PCR从含有全长GPC3的质粒中扩增C-GPC3基因,将其克隆至p3457-his载体中,构建重组真核表达质粒p3457-C-GPC3,转染293T细胞,对C-GPC3蛋白的表达进行Western blot鉴定。将质粒p3457-C-GPC3瞬时转染293E细胞,获得C-GPC3蛋白,采用Ni亲和柱纯化后,进行FITC标记。以本课题组构建的哺乳动物展示型全人源sc Fv抗体库为起始文库,FITC-C-GPC3抗原按照10、2和0.8 nmol/L的浓度梯度,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度最强、比例约为0.1%的阳性细胞。结果重组表达质粒p3457-C-GPC3经菌液PCR和测序鉴定证明构建正确;瞬时转染293T和293E细胞均可表达相对分子质量约为25 000的C-GPC3蛋白;获得了可与C-GPC3结合的阳性率约为0.1%的阳性细胞。结论成功构建了重组真核表达质粒p3457-C-GPC3,并从哺乳动物展示型全人源sc Fv抗体库中筛选出了阳性细胞,为后期全人源GPC3抗体的构建和表达奠定了基础。

人源抗BLyS单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:从人源单链抗体库中筛选抗B细胞刺激因子(BLy S)的单链抗体基因、构建表达载体并实现单链抗体的表达。方法:以哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库为起始文库,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度最强、比例为0.1%的阳性细胞。从候选细胞中提取质粒并转化至DH5α中进行扩增,得到质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需的抗体库。经过依次降低抗原浓度进行了3轮分选得到2个候选的Sc Fv序列。经序列分析,选择其中一种单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得B-10 Sc Fv抗体蛋白并通过Fortie Bio Octet QK进行亲和力分析。结果:经过3轮筛选获得了全新的抗BLy S Sc Fv抗体序列,成功构建并表达了anti-Bly S Sc Fv抗体蛋白,该单链抗体与的BLy S亲和常数为3.08 nmol·L-1。结论:从哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库中成功获得了可结合BLy S的全新单链抗体基因序列,该单链抗体与BLy S具有较高的亲和力,这为后续的活性研究以及产品开发奠定了基础。