哺乳动物病毒共受体的特征研究

为了探究哺乳动物病毒共受体间的共性特征,本研究基于ViralReceptor数据库中收集的哺乳动物病毒-受体相互作用关系,共收集277对病毒共受体组合,从结构、功能、进化和组织表达等方面对这些病毒共受体进行系统分析,并与来源于不同哺乳动物的病毒受体组合以及随机挑选的人类蛋白组合进行比较。结果显示,哺乳动物病毒共受体相较于其他蛋白组合,彼此间有更高的功能相似性,在宿主蛋白相互作用网络中相互作用的比例更高,在人体常见组织中的共表达水平更高。研究表明,哺乳动物病毒共受体具有功能、表达和互作等共性特征。期望此结果能为病毒受体的发现和鉴定等研究提供参考。

茶尺蠖小RNA病毒5′端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropisoblique小RNA病毒 (EoPV)中提取病毒基因组RNA ,逆转录后加poly(dT) ,然后进行两步PCR扩增基因组 5′端。克隆测序后 ,对其 5′端非编码区的核苷酸序列进行分析 ,发现具有哺乳动物小RNA病毒的 5′端非编码区的一些特征 :A T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构 ,存在4个茎环结构 ,有哺乳动物内部核糖体进入位点 (IRES)的保守区域 ,即含保守基序GNRA的茎环A和A C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。

哺乳动物正呼肠孤病毒反向遗传学研究进展

呼肠孤病毒科是分布最广的病毒类群之一,其中哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian Orthoreovirus,MRV)属于正呼肠孤病毒属,主要感染哺乳动物的呼吸道和肠道。近年来,MRV的反向遗传学操作技术取得了长足进步,运用该技术,在MRV基因组组装、基因功能及致病机制等方面都获得了较大突破。综述了MRV反向遗传学操作技术的建立过程及运用该技术取得的最新成果,并展望了该技术在呼肠孤病毒科其他病毒中的应用。

云南牛血液标本中哺乳动物正呼肠孤病毒(YNSZ/V207/2017)的分离鉴定

目的掌握云南省动物病毒的多样性和传播风险。方法在云南省师宗县设立10头哨兵牛,定期采血接种细胞进行病毒分离。通过RT-PCR、电镜观察、高通量测序与血清中和试验进行分离病毒的鉴定、全基因组序列获取与流行病学调查。结果2017年从采集的哨兵牛血液样本中分离出2株蓝舌病病毒、3株帕利亚姆病毒、2株流行性出血病病毒和1株待鉴定病毒(YNSZ/V207/2017)。电镜下YNSZ/V207/2017病毒粒子直径约80 nm,呈二十面体对称;全基因组序列分析显示其为哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian orthoreovirus,MRV)血清1型毒株(MRV-1),病毒的不同基因节段分别与人、白尾鹿、水貂、果子狸和棕蝠上分离MRV的序列相似度最高;血清中和试验表明当地牛、羊和猪中MRV-1的抗体阳性率分别为32.5%、20.0%和42.5%。结论在云南省牛血液标本中分离出1株MRV-1型毒株,该毒株可能为不同宿主来源的基因重配毒株,MRV-1在当地家畜中广泛流行。

大兴安岭全沟硬蜱携带哺乳动物腮腺炎病毒5型的分离鉴定

为了明确黑龙江省大兴安岭地区媒介生物蜱携带病原的本底情况,本研究采集黑龙江省大兴安岭呼玛县、漠河县、塔河县、白桦乡、三卡乡、塔列图河、五叉沟和加北乡各地区的全沟硬蜱作为研究对象,利用病毒宏基因组学分析方法,经Illumina HiSeq2000高通量测序,共得到78091166条读长,经生物信息学分析,结果显示,其中涵盖的序列主要包括布尼亚病毒、巴库病毒、哺乳动物腮腺炎病毒和汉坦病毒等,并进一步对哺乳动物腮腺炎病毒5型进行了分离鉴定,将通过PCR检测为哺乳动物腮腺炎病毒5型阳性的样品接种PK15细胞分离培养,结果显示出现明显的细胞病变,培养第5 d病毒滴度达1×10^(5.7)TCID^(50)/mL。盲传4代后经PCR鉴定为哺乳动物腮腺炎病毒5型阳性。进一步进行电镜观察,可见病毒粒子直径为50 nm~60 nm,完整的病毒粒子呈球形,有囊膜,且间接免疫荧光试验检测为阳性。经PCR扩增哺乳动物腮腺炎病毒5型全基因组序列并测序分析,结果显示该病毒的全长基因组序列与哺乳动物腮腺炎病毒5型的序列相似度高达96%,进一步验证了病毒宏基因组学分析结果。本研究首次从黑龙江省大兴安岭地区全沟硬蜱中分离得到一株哺乳动物腮腺炎病毒5型,为该地区蜱携带哺乳动物腮腺炎病毒5型的流行病学调查奠定了基础。

哺乳动物正呼肠孤病毒血清3型Dearingσ1蛋白纯化及其多克隆抗体制备

目的纯化哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)血清3型Dearing(T3D)σ1融合蛋白,制备T3Dσ1多克隆抗体。方法将T3DS1-pET28a重组质粒转化至Rosetta(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白大量表达,经组氨酸标签Ni-IDA层析柱纯化得到T3Dσ1融合蛋白。纯化得到的蛋白免疫新西兰白兔制备σ1蛋白特异性多克隆抗体。通过间接ELISA检测多克隆抗体效价,Western blot法及间接免疫荧光法(IFA)检测多克隆抗体特异性。结果T3Dσ1蛋白相对分子质量(Mr)约为32000,主要为包涵体形式,通过变性、复性处理纯化融合蛋白;免疫新西兰白兔成功制备出T3Dσ1效价大于1∶10^(6)的多克隆抗体,并成功应用于Western blot法及IFA检测。结论成功制备了高效价及高灵敏度T3Dσ1多克隆抗体。

广西地区腹泻仔猪呼肠孤病毒的感染及序列分析

为了解广西地区腹泻仔猪中哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)的感染情况及主要流行毒株,应用套式RT-PCR对广西部分地区2020-2022年173份腹泻猪样品进行检测,并选取部分阳性样品进行S 1基因扩增与分析,进一步了解广西地区MRV主要流行毒株的基因特征。结果显示,2020-2022年173份样品MR总阳性率为18%(32/173),各年阳性率分别为29.6%、9.9%和33%。获得1株S 1基因全长序列,序列比对结果发现该序列与其他MRV S 1基因序列的核苷酸同源性为43.4%~97.9%,氨基酸同源性为26.1%~97.8%;遗传进化分析显示,获得的毒株序列为MRV3型,与其他猪源MRV3型毒株ZJ2013、IND/MZ/3013789/reo在同一分支上,同属于谱系Ⅳ。结果表明广西地区猪群存在一定程度的MRV感染,为进一步防控广西腹泻猪群中MRV的流行提供科学依据。

禽呼肠孤病毒的分子特征和复制周期

禽呼肠孤病毒是Orthoreovirus属5种病毒之一,该属还包括非致融哺乳动物呼肠孤病毒、致融哺乳动物呼肠孤病毒和狒狒呼肠孤,以及从爬行动物中分离的致融病毒。禽呼肠孤病毒和哺乳动物呼肠孤病毒是Orthoreovirus属的两个主要类群,尽管它们有许多共同的分子特征和物理化学特征,但它们在宿主范围、致病性和基因组编码能力以及各种生物学和血清学特性方面有所不同。

二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLCMK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。

树鼩呼肠孤病毒RT-nPCR检测方法的建立及初步应用

目的建立树鼩呼肠孤病毒(TRV)RT-nPCR检测方法,为树鼩的质量控制提供检测方法。方法从三批野外来源的具有感染临床症状的树鼩粪便中分离得到三株病毒,经电镜观察和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)。根据GenBank中已发表的MRV L1基因的保守区域,设计合成巢式引物,对所分离的三株树鼩呼肠孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)的RNA进行RT-nPCR扩增,优化反应条件,进行特异性、敏感性试验。应用RT-nPCR方法对25只野外来源的相同症状疑似病例样本进行检测。结果针对分离到的三株树鼩呼肠孤病毒的RNA进行RT-nPCR扩增,均得到513 bp的特异性目的片段,培养细胞及甲肝病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒阴性对照均未扩增出条带。敏感性试验结果显示可检测到的最小RNA模板浓度为0.01 pg/μL。25只树鼩粪便样本经RT-nPCR检测,有14只TRV阳性,其中死亡动物组10只,检出率为100%;存活动物组15只,检出率为27%。结论建立的TRV RT-nPCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于TRV的常规检测。

鸡减蛋综合征病毒DNA的基因文库构建和酶切位点分析

腺病毒载体已经成为基因工程疫苗及癌症、遗传病基因治疗的重要工具。腺病毒可分为哺乳动物腺病毒和禽腺病毒,禽腺病毒包括20多个血清型,分别归属于三个群:Ⅰ群为传统的禽腺病毒(FAV),Ⅱ群包括火鸡出血性肠炎病毒(HEV)等,Ⅲ群禽腺病毒为减蛋综合征病毒(EDSV)。这些病毒广泛地存在于多种禽类的呼吸道、消化道,大多呈显性或不显性感染。以禽类腺病毒为载体表达禽类重要病原的保护性抗原基因,构建多价(联)活载体基因工程疫苗。

牦牛源正呼肠孤病毒2型的检测和分离鉴定

旨在调查川西北牦牛哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)的感染情况并分离病毒。采用RT-PCR方法,对采自川西北15个牧场的72份牦牛腹泻粪便样本和其中5个牧场的15份腹泻牦牛血清样本进行MRV检测,阳性样本进一步用分型PCR确定其血清型。结果显示,粪便样本中MRV检出率为20.83%(15/72),血清2型的比例为60%(9/15);血清样本中MRV检出率为40%(6/15),血清2型的比例为83.33%(5/6);未检测到其他血清型。成功地从腹泻粪便中分离到1株MRV血清2型毒株(TCID_(50)为4×10^(-8.56)·mL^(-1)),并获得长度为23587 bp的分离株全基因组,该分离株与中国猪源毒株的遗传关系最近;与GenBank中所有的MRV S1基因相比,该分离株有4个独特的氨基酸突变。本研究从牦牛中检测到MRV,并分离到1株牛源MRV血清2型毒株,为进一步研究MRV血清2型生物学特性奠定了基础。

猪圆环病疫苗的研究进展

猪圆环病毒（Porcine Circovirus,PCV）是圆环病毒科（Circoviridae）、动物圆环病毒属的成员。该病毒科是国际病毒分类委员会（ICTV）第6次学术报告会新命名的一个科,是已知能自行复制的最小的哺乳动物病毒。PCV可以分为PCV1和PCV2两种血清型。PCV1无致病性,但广泛存在猪体内及猪源代细胞系,1974年,Tischer首次从PK-15猪肾传代细胞系中分离。

动物流感病毒与人类流感病毒的相互关系

纵观流感发生的历史,人类流感引发的历次大流行与动物的流感都有着密切相关的联系;种种迹象也表明,动物流感的频频暴发,对人类健康和生命安全具有巨大的威胁作用。基于此,对人类流感病毒与动物流感病毒的相互关系进行了综述。

腺病毒介导高血压相关基因转移对兔颈动脉球囊损伤后新生内膜形成的抑制作用

目的 探讨腺病毒载体介导的新基因高血压相关基因(Hypertension-related gene,HRG-1)转移对兔颈总动脉球囊损伤后新生内膜形成的影响。方法 兔颈总动脉球囊损伤后,经血管腔内转染含有HRG-1的腺病毒载体(AdHRG-1)或含有绿色荧光蛋白报告基因的空载腺病毒载体(AdGFP),以生理盐水处理为对照。于术后3、7和28 d取材,分别进行外源基因表达检测、PCNA染色和定量组织形态学分析。结果 应用逆转录-聚合酶链反应和免疫组织化学方法分别证实了基因转移后3 d HRG-1在兔颈动脉壁内的表达;PCNA免疫组织化学染色显示,转染AdHRG-1后7 d兔颈动脉内膜和中膜PCNA阳性细胞指数较转染AdGFP组明显降低[(21.4±2.5)％对(45.6±3.8)％,(6.4±1.1)％对(17.8±1.9)％,P<0.05]。基因转移后28 d血管壁定量组织形态学分析显示,转染AdHRG-1组血管新生内膜面积及内膜面积与中膜面积比均显著低于转染AdGFP组[(0.13±0.03)mm2对(0.45±0.14)mm2,0.19±0.02对0.70±0.15,P<0.01],血管腔面积则显著增加[(0.88±0.07)mm2对(0.57±0.27)mm2,P<0.01],而转染AdGFP组与生理盐水处理组间无显著性差异。结论 以腺病毒为载体经血管腔内转染HRG-1可有效抑制球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成。

生物信息学分析包膜与非包膜病毒的受体蛋白差异

病毒与受体相互作用对于病毒感染宿主细胞至关重要。为了深入理解病毒对于受体蛋白的选择机制,本研究从结构、功能、宿主蛋白相互作用网络以及组织表达量等四个方面系统性地分析和比较了哺乳动物中包膜与非包膜病毒的受体蛋白差异。结果表明,包膜病毒和非包膜病毒的受体蛋白具有相似的结构域组成和功能,但是非包膜病毒的受体蛋白相对于包膜病毒具有更多的结构域数目、更高的N-糖基化水平、在宿主蛋白相互作用网络中有更高的连接度和节点介数、以及在宿主中有更高的表达。本研究有助于加深我们对于哺乳动物中包膜与非包膜病毒受体选择机制的理解,同时也对病毒受体的鉴定具有一定的参考价值。

一株猪源1型呼肠孤病毒的分离及鉴定

为了研究猪呼肠孤病毒的分子生物学特性,通过在细胞培养液中添加胰酶的方法,从仔猪腹泻粪样中分离、纯化并鉴定了1株能在Vero细胞上稳定产生细胞病变,以细胞颗粒增多、肿胀、漂落等细胞病变为主要特征的猪源1型呼肠孤病毒SHR-A株。根据呼肠孤病毒的理化特性,对病毒进行初步纯化,然后进行电镜观察、核酸提取、RNA电泳、RT-PCR、各病毒基因扩增和克隆测序等常规病毒学鉴定。SHR-A株S1基因的同源性分析和核苷酸系统发育进化树分析表明,该病毒与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型的同源性较高,而与血清2型和3型的同源性较低,因此初步判断该SHR-A株为血清1型,为国内首次报道从猪体内分离到血清1型的呼肠孤病毒。进一步分析发现,SHR-A的S1基因全长为1 465bp,其3′-UTR为3型,其余部分则为1型,说明其S1基因是1型和3型的嵌合体,此结果表明,哺乳动物呼肠孤病毒作为RNA病毒,基因重组可能是其除基因突变和基因重排以外的第3种病毒变异进化的重要方式。

检测黑猩猩腺病毒68型抗原的双抗体夹心ELISA的建立

目的 建立定量黑猩猩腺病毒68型(chimpanzee adenovirus type 68,AdC68)含量的双抗体夹心ELISA,并验证其可行性.方法 用表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的非复制型AdC68(AdC68GFP)感染HEK293细胞,收获病变细胞并进行超速离心纯化AdC68GFP.用纯化AdC68GFP免疫家兔制备抗AdC68GFP抗体.以抗AdC68GFP抗体为包被抗体,辣根过氧化物酶标记的抗腺病毒HEXON IgG为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA,确定该法的线性范围,并验证该法的准确度、精密度、专属性和适用性.结果 纯化AdC68GFP的蛋白浓度为38.8 μg/ml,其中HEK293细胞蛋白浓度低于0.3 μg/ml.双抗体夹心ELISA的最适包被抗体和酶标抗体浓度分别为1∶50和1∶500.该法的线性范围为0.06~3.88 μg/ml,线性相关系数为0.999 6.高、低浓度AdC68GFP样品的回收率分别为93.17%和94.33%,变异系数分别为6.72%和3.44%.该法可特异性检测AdC68GFP抗原,未发现与HEK293细胞蛋白发生交叉反应.应用该法检测AdC68GFP纯化过程中的样品可反映病毒的纯化效果.结论 建立的双抗体夹心ELISA具有良好的准确度、精密度和专属性,可用于AdC68纯化工艺过程中对病毒蛋白含量的快速检测.

高滴度呼肠孤病毒3型的制备及滴度检测

目的 制备高滴度呼肠孤病毒3型（reovirus 3,Reo-3）病毒液,并检测Reo-3滴度.方法 以幼仓鼠肾细胞（BHK-21）为病毒培养基质和滴度测定细胞.将Reo-3按10^0至10^-5感染复数（MOI）接种BHK-21,再分别用细胞病变法和蚀斑形成法检测病毒,用Karber法计算病毒滴度.结果 BHK-21感染Reo-3后能产生明显病变.以10^-4 MOI的Reo-3接种后48 h,收获液中病毒滴度最高,细胞病变法检测为9.625 lgTCID50/ml,蚀斑形成法检测为8.671 lgPFU/ml.结论 制备了高滴度Reo-3,为开展该病毒去除灭活研究奠定了基础.

SENP1在人神经胶质瘤细胞中的重要作用

目的 探讨小泛素相关修饰物（SUMO）特异性蛋白酶-1（SENP1）对神经胶质瘤细胞的生长和侵袭能力的影响.方法 采用腺病毒感染方法敲除胶质瘤细胞LN229的SENP1基因,然后用双染法检测基因敲除后对细胞增殖和细胞凋亡的影响,并用Tanswell小室法检测基因敲除后胶质瘤细胞迁移能力的改变.结果 敲除SENP1后的LN229细胞增殖与对照组相比明显被抑制,双染实验发现SENP1敲除可以促进肿瘤细胞凋亡.且进一步功能实验表明SENP1敲除后的肿瘤细胞的迁移能力明显下降.结论 SENP1可以促进细胞增殖,降低细胞凋亡率,并影响肿瘤细胞侵袭基因的表达,在神经胶质瘤发病和进展过程中发挥着十分重要的作用.