哺乳动物细胞表达系统研究进展

哺乳动物细胞表达系统具有强大的翻译后修饰功能,表达的重组蛋白更接近人源构象,因此被广泛用于治疗性重组蛋白的生产,其中应用最广泛的是中华仓鼠卵巢细胞。基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等研究的不断深入促进了哺乳动物细胞表达系统的不断完善。本文立足于哺乳动物细胞表达系统的研究现状,对表达载体的优化、宿主细胞和位点特异性重组等方面的最新进展进行综述。

禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白的哺乳动物细胞表达系统表达及鉴定

利用哺乳动物细胞表达系统对禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白进行表达,并检测所表达融合蛋白的抗原性。首先将N基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组真核表达载体,然后将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜检测N蛋白的表达,并用Western blot检测表达蛋白的抗原性。结果显示,禽偏肺病毒核衣壳N蛋白主要表达在细胞浆中,在转染后48h后表达量最高;与抗N蛋白抗体有抗原性,所表达核衣壳N融合蛋白大小为72kDa左右,与预期结果一致。结论,本试验成功应用哺乳动物表达系统表达了禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白,表达蛋白具有抗原性,为与禽偏肺病毒核衣壳N蛋白的相关研究奠定了基础。

我国科学家开发精准可控的哺乳动物细胞基因表达系统

哺乳动物细胞中,精确调控基因线路对于细胞适应环境、稳态维持和发育分化等生理功能至关重要。关键基因表达过量或不足都可能导致癌症等疾病,而多个细胞命运决定因子的表达剂量也是重塑细胞命运分化和发育的关键因素。但在哺乳动物细胞中,基因表达受到基因顺序、基因组位置等多种复杂因素的影响,使得精确控制基因表达剂量变得非常困难。因此,亟需开发模块化、不受细胞类型影响且可编程的基因表达系统。

四环素调控表达系统调节EGFP和HBV前核心蛋白在哺乳动物细胞中表达

构建新型四环素调控的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和乙肝病毒(HBV)前核心蛋白基因的表达载体,利用脂质体转染哺乳动物细胞,流式细胞术检测结果说明:应用此系统四环素可使EGFP在CHO细胞中的表达提高18倍,在SSMC-7721细胞与HEK293细胞中的表达分别提高5倍和接近2倍,并且,四环素可有效地诱导HBV的前核心蛋白基因在肝癌细胞系中的表达。

变异链球菌葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区真核表达质粒的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建变异链球菌葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区的真核表达质粒pVAX1-GbpA/GBD,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。方法:利用基因重组技术构建真核表达质粒pVAX1-Gb-pA/GBD,经酶切分析和测序分析鉴定后,通过脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,免疫组化SABC法检测其在细胞中的表达。结果:重组质粒pVAX1-GbpA/GBD经EcoR I和BamH I酶切证实携带1.2kb目的基因片段,经测序分析,目的基因正确插入到预先设计的载体位点处。pVAX1-gbpA/GBD转染的细胞胞质呈褐色染色,pVAX1空载体质粒转染的细胞胞质中无着色。结论:成功构建防龋基因疫苗真核表达质粒pVAX1-GbpA/GBD,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白。

短双链RNA特异性抑制哺乳动物细胞中绿色荧光蛋白基因表达

背景与目的:双链RNA特异性地降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默。本研究旨在探讨绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)的短双链RNA(shortinterferingRNAs,siRNAs)是否能抑制GFP在哺乳动物细胞中的表达。方法:用荧光显微镜和荧光分光光度计观察合成的GFPsiRNAs对绿色荧光蛋白表达基因pEGFPC2在HeLa细胞中表达的影响,同时观察长链GFPdsRNA、Cx26siRNAs和长链Cx26dsRNA对荧光蛋白表达的影响,并通过流式细胞仪观察上述不同种类的dsRNA对细胞凋亡的影响。结果:GFPsiRNAs能特异性抑制GFP基因在HeLa细胞中的表达,而Cx26siRNAs对荧光蛋白的表达没有影响。长链双链RNA可以诱导细胞的凋亡,而siRNAs对细胞的凋亡无影响。结论:siRNAs能在哺乳动物特异性抑制基因的表达,该研究将为利用siRNA作为一种治疗手段提供一定的理论依据。

哺乳动物细胞表达系统及其研究进展

从表达载体、宿主细胞、表达系统的类型及选择等四个方面对哺乳动物细胞系统进行了综述。对相关的研究进展,如高效启动子的发现和改构、新型细胞株的建立及诱导表达调控系统亦作了简要介绍。通过这些阐述,期望能建立一个简洁而清晰的有关该表达系统的框架,对在实验中决定选取何种载体、细胞株或何种表达方式时能够有所提示。

基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术

抗体等重组蛋白产品是以基因工程和细胞工程为关键技术的生物技术产品，其特异性高、均一性好、靶点明确，广泛应用于各类重大疾病、尤其是对肿瘤治疗。目前，在FDA批准的32种抗体药物治疗疾病的分类中，肿瘤类疾病占32％、免疫性疾病占37％、器官移植疾病占11％、感染性疾病占8％、心血管疾病占4％、其他疾病占6％。

哺乳动物悬浮细胞表达系统进行膜蛋白制备的优化

为提高哺乳动物悬浮细胞表达系统用于日常膜蛋白表达制备的实用性、可控性及效率,改善传统工艺缺乏快速检测和质控的方法、缺乏快速且高通量的目的蛋白及融合标签的筛选策略等方面的不足,设计了新的pf系列质粒,优化并建立关联的检测方法,实现了病毒滴度在转染和扩增阶段的随时监测,并缩短了定量测量病毒感染效力的周期;同时设计了新的筛选策略和ESNX质粒系列,实现了目的蛋白和融合标签质粒库的快速构建以及对其表达效果的快速、高通量检测筛选。基于新质粒和对应使用方案的膜蛋白表达制备新体系提高了效率、实用性和可控性,可以简单地再现并用于各实验室,为膜蛋白的结构、功能等各方面研究提供助力。

哺乳动物细胞高效表达系统研究进展

哺乳动物细胞高效表达系统是基因工程制药研究中的一个重要内容,而表达载体和宿主细胞是哺乳动物细胞表达系统的2个基本组成部分。近年来通过降低目的基因的位置效应、提高目的基因的转录和翻译水平以及目的基因的拷贝数等方面构建哺乳动物细胞高效表达载体。与此同时,研究者也对宿主细胞进行了多方面的改造,使之能更好地适应工业化大规模培养的要求,从而降低细胞培养和产品纯化的成本。本文就哺乳动物细胞高效表达载体的构建及宿主细胞的改造等方面的最新进展作一简述。

一种在哺乳动物细胞中研究蛋白分子转录激活活性系统的建立

为了在哺乳动物细胞中建立一套用于研究蛋白分子转录激活活性的系统 ,首先以质粒pTet Off和真核表达载体pCDNA3.1B( ) /myc his为基础 ,分别构建重组质粒pZHO1(用于插入待测基因并作为该系统的阴性对照 )、pZHO2(用于作阳性对照 ) ,此外 ,该系统还包括质粒pTRE luc(编码Firefly荧光素酶报道基因 )和质粒pRL TK(编码Renilla荧光素酶基因 ,用作内参对照 )。为验证该系统的可行性 ,分别将质粒pZHO1、pZHO2、pZHO3(编码p5 3分子N端转录激活区 73个氨基酸片段 ,作为实验组 )与质粒pTRE luc和pRL TK共转染至C4 2、MCF 7、COS73种不同的细胞株中 ,通过检测各转染组细胞中Firefly荧光素酶相对活性的大小来判断该系统的可行性。结果表明 ,所构建的系统可以在哺乳动物细胞中检测目的分子的转录激活活性。

用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达新技术

近年来,用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达领域涌现出一系列革命性的新技术。优化的工程细胞为表达重组蛋白提供了优良的宿主;基于荧光的筛选方法可以快捷地得到高表达细胞株;高通量的培养工艺能够预测适合外源蛋白表达的细胞培养条件;可抛弃式生物反应器为大规模细胞培养提供了更多的选择;大规模瞬时表达技术节省了重组蛋白的生产时间。这些新技术提高了重组蛋白的研发和生产效率,加快了蛋白药物的工业化进程。

牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵袭蛋白4E的原核表达、纯化及其圆二色谱分析

为了阐明牛分枝杆菌侵入宿主细胞和在肺泡巨噬细胞长期存活的机理,本研究以牛分枝杆菌的DNA为模板,通过PCR的方法扩增克隆牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵袭蛋白4E(Mammalian cell-entry protein 4E,mce4 E)基因,将所扩增基因克隆于原核表达载体pET30a(+)并进行测序,结果显示该基因与GenBank上所公布的牛分枝杆菌和人分枝杆菌mce4 E基因同源性为100%。将重组表达载体转入宿主菌BL21进行诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析和Western-blotting免疫印迹鉴定,结果证明目的蛋白获得高效表达,表达量占菌体总量的53.3%,分子量约为45 ku;利用Ni-NTA琼脂糖柱对表达蛋白进行纯化,纯化率大于95%;纯化的蛋白经过透析复性、圆二色谱(CD)测定,结果表明重组蛋白为典型的α螺旋型结构,经Jascow32软件分析计算,mce4E蛋白含有39.1%的α螺旋,60.9%的无规卷曲,无β-折叠和转角,为进一步开展牛分枝杆菌致病机理的研究和寻找新的药物作用靶位点奠定了基础。

牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵入蛋白4A(Mce4A)的原核表达、纯化及其圆二色谱分析

将牛分枝杆菌哺乳动物细胞侵入蛋白4A(Mammalian cell-entry protein 4A,Mce4A)基因克隆至原核表达载体pET30a(+)中,得到重组表达载体pET30-mce4A,转入宿主菌BL21(DE3)中,获得大量表达,表达量占菌体蛋白总量的52%,大小约为43 Ku。经Ni-NTA琼脂糖亲和层析获得Mce4A重组蛋白;圆二色谱(CD)测定结果表明,Mce4A重组蛋白α螺旋含量为31.1%,β-折叠含量为0%,无规卷曲含量为61.0%,转角含量为7.9%。为进一步开展牛分枝杆菌致病机理的研究和寻找新的药物作用靶位点奠定了基础。

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因防龋疫苗的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的 :观察变形链球菌葡聚糖结合蛋白 B( gbp B)真核表达质粒 pc DNA3 .1 ( +) -gbp B在哺乳动物细胞 COS-7的表达情况。方法 :通过基因重组技术构建真核表达质粒 pc DNA3 .1 ( +) -gbp B,通过脂质体转染法将其转染至 COS-7细胞 ,通过免疫组化 SABC法检测其在 COS-7细胞的表达。结果 :pc DNA3 .1( +) -gbp B质粒转染的细胞胞浆中呈棕黄色染色 ,胞核中无着色 ,pc DAN3 .1 ( +)空载体转染的细胞胞浆及胞核无着色 ,空白对照组也无着色。结论 :质粒 pc DNA3 .1 ( +) -gbp B转染 COS-7后能够在细胞内翻译、表达 ,表达的蛋白质位于胞浆中 ,可与抗 Gbp B抗体特异性结合 ,具有抗原性 ,可作为基因疫苗。

BLyS受体TACI、BCMA与人IgG1 Fc融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达与鉴定

从人肝脏和肾脏cDNA文库中扩增了人IgG1Fc与B淋巴细胞刺激因子 (BLyS)的受体TACI及BCMA的胞外编码区 ,构建了TACI Fc及BCMA Fc融合表达质粒pSec1 Fc TACI与 pSec1 Fc BCMA ,并使用电穿孔法转染COS 7细胞 ,从 1L无血清培养上清中可纯化得到分泌表达的TACI Fc与BCMA Fc融合蛋白约 2mg。为获得TACI Fc与BCMA Fc的稳定来源 ,构建了TACI Fc与BCMA Fc的CHO稳定表达细胞株。免疫沉淀和ELISA结果显示 ,TACI Fc及BCMA Fc能特异性地结合其配体BLyS而不与BLyS同家族的TNF结合。TACI Fc及BCMA

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的 探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点。方法 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MOI的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系。通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度。结果 发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2d最高,至少可持续9d。Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异。结论 重组杆状病毒可以用于体外基因转导。

猪瘟病毒E2基因的哺乳动物细胞表达

利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。

重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达

目的研究重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的表达。方法用RT-PCR法从人胎肝中克隆出人蛋白C轻重链基因,用PCR突变法获得人活性蛋白C的全基因,将所得全基因连接入哺乳动物细胞表达载体,并转染293细胞研究其表达和活性。结果成功得到重组人活性蛋白C基因,并成功构建哺乳动物细胞表达载体和转染293细胞获高效表达以及相关活性数据。结论通过以上方法可以获得重组人活性蛋白C基因,并实现了在哺乳动物细胞中的高效表达。

杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体及其在医学中的应用

杆状病毒载体表达系统已被广泛用于在受纳昆虫细胞中大量表达外源蛋白。近年的研究发现 ,这种表达载体还可用来介导外源基因投送至各种哺乳动物细胞 ,并且通过哺乳动物启动子的驱动使外源蛋白得到高效稳定的表达 ,而其自身基因组并不复制和表达。同时 ,经过适当的修饰或预处理 ,杆状病毒表达载体还可介导外源基因在哺乳动物体内表达。由于这种载体的容量大 ,感染、表达效率高 ,生物安全性好 ,因而在基因治疗、疫苗开发、药物筛选等医学各领域具有广泛的应用前景。