大鼠神经肽Y前体cDNA克隆、测序及哺乳动物细胞表达载体的构建

利用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从大鼠脑组织中钓得神经肽Ｙ前体ｃＤＮＡ编码区序列，将该ｃＤＮＡ定向亚克隆入哺乳动物细胞表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ中，构建了重组质粒ｐＲｃ／ＣＭＶ－ＮＰＹ。经双脱氧核苷酸终止法对插入片段作序列分析，证明ＮＰＹｃＤＮＡ序列的准确性及插入方向正确。

杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体及其在医学中的应用

杆状病毒载体表达系统已被广泛用于在受纳昆虫细胞中大量表达外源蛋白。近年的研究发现 ,这种表达载体还可用来介导外源基因投送至各种哺乳动物细胞 ,并且通过哺乳动物启动子的驱动使外源蛋白得到高效稳定的表达 ,而其自身基因组并不复制和表达。同时 ,经过适当的修饰或预处理 ,杆状病毒表达载体还可介导外源基因在哺乳动物体内表达。由于这种载体的容量大 ,感染、表达效率高 ,生物安全性好 ,因而在基因治疗、疫苗开发、药物筛选等医学各领域具有广泛的应用前景。

利用慢病毒载体快速建立表达外源基因的哺乳动物细胞系

建立稳定表达外源基因的哺乳动物细胞系是一项重要的生物技术,介绍了联合使用慢病毒载体和流式细胞仪分选技术来建立稳定表达绿色荧光蛋白的293T细胞系。结果表明,在1个月左右的时间里即可获得表达绿色荧光蛋白的293T细胞系,阳性细胞率高达96.5%,而且建立的细胞系能够稳定传代。因此,联合慢病毒载体和流式细胞仪分选技术的策略对于建立稳定表达外源基因的哺乳动物细胞系快捷和可靠。

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的 探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点。方法 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MOI的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系。通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度。结果 发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2d最高,至少可持续9d。Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异。结论 重组杆状病毒可以用于体外基因转导。

哺乳动物细胞表达系统研究进展

哺乳动物细胞表达系统具有强大的翻译后修饰功能,表达的重组蛋白更接近人源构象,因此被广泛用于治疗性重组蛋白的生产,其中应用最广泛的是中华仓鼠卵巢细胞。基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等研究的不断深入促进了哺乳动物细胞表达系统的不断完善。本文立足于哺乳动物细胞表达系统的研究现状,对表达载体的优化、宿主细胞和位点特异性重组等方面的最新进展进行综述。

哺乳动物细胞高效表达载体的优化

目的:优化哺乳动物细胞表达系统,提高目的基因的表达效率。方法:以组织型纤溶酶原激活剂(tPA)为报告基因,利用本实验室建立的CHOfrt/dhfr-细胞定点整合表达系统,对多种表达调控元件(包括hCMV和hEF-1α启动子、hCMV增强子、hEF-1α1st内含子及翻译增强子H213和V163等)及其多种组合的表达效率进行了系统的比较和评价。结果:hCMV启动子与H213组合以及hEF-1α启动子与V163组合的表达效率分别是仅含hCMV启动子的156.6%和139.5%。结论:该研究为构建高效的哺乳动物细胞表达载体奠定了基础。

pcDNA3.1^+-MBL真核表达载体构建及其在不同哺乳动物细胞株中的表达

目的 比较人甘露聚糖结合凝集素 (MBL)基因在不同哺乳细胞株中的表达效率。方法 应用PCR从含有中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM MBL中扩增目的基因片段 ,将其克隆至pcDNA3.1+ 表达载体 ,经酶切及测序鉴定后 ,以电穿孔法转染CHO、HEPG2和HEK2 93细胞 ,以RT PCR、ELISA分析其在 3株细胞中的表达情况。结果 从pGEM MBL中扩增得到约 75 0bp的MBLDNA片段 ,构建成重组表达载体pcDNA3.1+ MBL ,经酶切出现 75 0bp片段 ,测序鉴定与预期的完全一致。将其转染进细胞后 ,经G4 18选择转染子并克隆化培养 ,RT PCR和ELISA分析显示 ,在CHO和HEK2 93细胞中及培养上清液中分别有较高的MBLmRNA和蛋白表达 ,而HEPG2细胞表达较低。结论 人MBL在CHO和HEK2 93细胞中的表达效率较高 。

丙型肝炎病毒结构蛋白真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)结构蛋白的真核表达载体。方法 :用RT PCR方法扩增HCV结构基因 ,并将其克隆入真核表达载体pcDNA3中 ,用磷酸钙转染法将其转入Sp2 / 0细胞 ,用免疫组化法检测细胞中瞬时表达的目的蛋白。结果 :克隆的基因片段全长约 1.9kb ,包括C及E2的全长和E1的部分。免疫组化显示表达蛋白位于细胞浆中。结论 :构建的丙型肝炎病毒结构蛋白的真核表达载体能够在哺乳动物细胞中得到表达 。

基于哺乳动物细胞系的重组乙酰胆碱酯酶表达载体构建研究

目的 构建具有不同信号肽、载体骨架元件以及乙酰胆碱酯酶编码基因序列的真核表达载体,为基于哺乳动物细胞系表达重组乙酰胆碱酯酶提供前期研究基础。方法 通过NCBI数据库查询苍蝇头部、电鳗鱼电器官来源的乙酰胆碱酯酶基因序列(mdAChE和eleelAChE),经密码子优化后,选择Humaninsulin、小鼠重链、Human CD33 3种信号肽序列,将其与合成的上述目的基因连接后分别与pCMV3、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.4 3种载体骨架元件进行组合,构建重组乙酰胆碱酯酶的表达载体,随后分别在CHO-S、Expi293F细胞系进行瞬时转染表达,产物采用镍柱亲和纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)与蛋白免疫印迹(Western blot)分析鉴定。结果 经菌液聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)及DNA测序鉴定,成功构建了4种重组mdAChE酶的表达载体以及3种重组eleelAChE酶的表达载体。SDS-PAGE、Western blot的结果表明,基于pcDNA3.1(+)和pcDNA3.4载体骨架元件的重组表达载体可实现重组mdAChE和eleelAChE酶的可溶性表达;以p CMV3为载体骨架元件的表达载体,仅在以Human CD33为信号肽时,能在CHO-S细胞系中实现重组mdAChE酶的可溶性表达,其余情况下均未见有效表达。结论 实现了昆虫、鱼类来源的重组乙酰胆碱酯酶在哺乳动物细胞系的可溶性表达,发现载体骨架元件、信号肽类型对其重组表达具有重要影响, CHO-S以及Expi293F细胞均适合重组乙酰胆碱酯酶的表达,后续还需对影响其酶活、农药敏感性的关键限制性因素开展深入研究。

哺乳动物细胞表达外源基因常用病毒载体的研究进展

文章概述了逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等四种常用哺乳动物细胞表达外源基因的病毒载体系统的来源、组成、特点及应用方面研究的进展.

过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株

背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。结果与结论:(1)测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;(2)过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×10~9 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×10~9 TU/mL;(3)确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3μg/mL;(4)过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;(5)过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。

人白介素-11真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

白介素11(IL-11)是一种调节造血细胞的重要细胞生长因子。

哺乳动物细胞高效表达系统研究进展

哺乳动物细胞高效表达系统是基因工程制药研究中的一个重要内容,而表达载体和宿主细胞是哺乳动物细胞表达系统的2个基本组成部分。近年来通过降低目的基因的位置效应、提高目的基因的转录和翻译水平以及目的基因的拷贝数等方面构建哺乳动物细胞高效表达载体。与此同时,研究者也对宿主细胞进行了多方面的改造,使之能更好地适应工业化大规模培养的要求,从而降低细胞培养和产品纯化的成本。本文就哺乳动物细胞高效表达载体的构建及宿主细胞的改造等方面的最新进展作一简述。

杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究

研究已证实杆状病毒可进入某些哺乳动物细胞 ,这提示了可将重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。利用已构建的重组杆状病毒BacV CMV EGFPA ,以含病毒的Sf9细胞培养上清同时孵育多种哺乳动物细胞 ,利用流式细胞术检测报告基因在不同细胞株中的转移效率及表达效率。共使用了 2 0种哺乳动物细胞株 ,其中有 12种人类组织细胞 ,7种小鼠组织细胞 ,1种猴组织细胞。实验结果显示携带CMV启动子的重组杆状病毒可有效进入多数哺乳动物细胞 ,其中对人、猴来源细胞的基因转移效率显著高于对鼠源细胞 ,对贴壁细胞的基因转移效率显著高于对悬浮细胞。同时 ,通过脂质体LipofectAMINE将携带有CMV启动子和EGFP基因的哺乳动物细胞表达质粒pCDNA3 1 EGFP分别转染部分特别是被认为杆状病毒进入能力较低的细胞株 ,结果显示CMV启动子在这些细胞中均可有效引导EGFP基因的表达 ,因此认为携带了CMV启动子的重组杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移效率能基本反映出杆状病毒对不同种哺乳动物细胞的进入能力。通过综合比较携带CMV启动子的杆状病毒对不同种属及组织来源细胞的基因转移及表达效率 ,可看出杆状病毒对灵长类动物贴壁细胞的基因转移及表达效果是较好的 。

重组质粒pcDNA3/sIL-1R(I)在哺乳动物细胞中的表达

目的 检测重组质粒pcDNA3 sIL_1R(I)在哺乳动物细胞系COS_1和CHO细胞中的表达。方法 采用脂质体介导基因转染技术 ,将已构建的pcDNA3 sIL_1R(I)质粒DNA导入体外培养的哺乳动物细胞系COS_1和CHO细胞中。加入G4 18对转染的细胞加压筛选 ,获得稳定转染的细胞。酶联免疫吸附实验 (ELISA)对重组质粒在COS_1和CHO细胞表达产物的含量进行检测。结果 G4 18筛选获得稳定转染的COS_1和CHO细胞 ,对照组加压后第10～ 2 0天细胞全部死亡。转染组第 15～ 2 3天汇片达 80 %左右。转染组细胞培养液和冻融液中sIL_1R表达量均显著高于对照组 (P <0 0 5 )。结论 以sIL_1R胞外成熟肽编码区基因作为目的基因构建的重组质粒pcDNA3 sIL_1R(I)在哺乳动物细胞系中具有表达功能。

杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞 ,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因 ,利用Bac to Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达 ,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用 ,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度 ,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时 ,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染 4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示 ,将带毒Sf9细胞培养上清 (1.2× 10 7PFU mL)用哺乳动物细胞培养基 1倍稀释后 ,37℃下孵育靶细胞 12h(moi=5 0 ) ,可达到较高的基因转移及表达效率 ,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较 ,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为 ,

哺乳动物细胞表达系统及其研究进展

从表达载体、宿主细胞、表达系统的类型及选择等四个方面对哺乳动物细胞系统进行了综述。对相关的研究进展,如高效启动子的发现和改构、新型细胞株的建立及诱导表达调控系统亦作了简要介绍。通过这些阐述,期望能建立一个简洁而清晰的有关该表达系统的框架,对在实验中决定选取何种载体、细胞株或何种表达方式时能够有所提示。

短双链RNA特异性抑制哺乳动物细胞中绿色荧光蛋白基因表达

背景与目的:双链RNA特异性地降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默。本研究旨在探讨绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)的短双链RNA(shortinterferingRNAs,siRNAs)是否能抑制GFP在哺乳动物细胞中的表达。方法:用荧光显微镜和荧光分光光度计观察合成的GFPsiRNAs对绿色荧光蛋白表达基因pEGFPC2在HeLa细胞中表达的影响,同时观察长链GFPdsRNA、Cx26siRNAs和长链Cx26dsRNA对荧光蛋白表达的影响,并通过流式细胞仪观察上述不同种类的dsRNA对细胞凋亡的影响。结果:GFPsiRNAs能特异性抑制GFP基因在HeLa细胞中的表达,而Cx26siRNAs对荧光蛋白的表达没有影响。长链双链RNA可以诱导细胞的凋亡,而siRNAs对细胞的凋亡无影响。结论:siRNAs能在哺乳动物特异性抑制基因的表达,该研究将为利用siRNA作为一种治疗手段提供一定的理论依据。

变异链球菌葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区真核表达质粒的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建变异链球菌葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区的真核表达质粒pVAX1-GbpA/GBD,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。方法:利用基因重组技术构建真核表达质粒pVAX1-Gb-pA/GBD,经酶切分析和测序分析鉴定后,通过脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,免疫组化SABC法检测其在细胞中的表达。结果:重组质粒pVAX1-GbpA/GBD经EcoR I和BamH I酶切证实携带1.2kb目的基因片段,经测序分析,目的基因正确插入到预先设计的载体位点处。pVAX1-gbpA/GBD转染的细胞胞质呈褐色染色,pVAX1空载体质粒转染的细胞胞质中无着色。结论:成功构建防龋基因疫苗真核表达质粒pVAX1-GbpA/GBD,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白。

端粒酶活性在哺乳动物细胞中的表达

为研究端粒酶活性在哺乳动物细胞中的激活 ,构建了端粒酶催化亚基 (human telomerase reverse transcriptase,h TERT)和端粒酶 RNA组分 (h TR)基因的真核表达载体 ,分别在无端粒酶活性的 DK细胞株和人肝癌细胞中进行表达 ,以 TRAP-银染和 TRAP- EL ISA定量方法测定转染细胞。结果显示 ,在人肝癌细胞株中仅 h TERT表达即可使端粒酶活性显著增加 ,而 DK细胞中 h TERT必须和 h TR同时转染才有端粒酶活性表达。这一结果表明 ,端粒酶活性表达主要和 h TERT/ h TR有关 ,采用人的端粒酶 h TERT/ h TR在其他哺乳动物细胞中表达端粒酶活性是可行的。