采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库

目的采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库。方法分离肾癌患者的外周血淋巴细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体全长Kappa型轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,分别插入载体pDGB-HC-TM,电击转化感受态大肠杆菌TOPO10,构建轻、重链抗体基因库,然后将轻、重链抗体基因库联合转染293T细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在293T细胞表面的表达。结果成功构建IgG1-Kappa型抗肾癌抗体基因库,随机挑选的克隆经DNA序列分析显示轻、重链库的序列正确性达90%(9/10)和80%(8/10),流式细胞仪分析显示来自轻、重链库的上述克隆各有7个可检测到相应基因在293T细胞表面的表达,可表达抗体库库容量高达7.5×1010。结论 IgG1-Kappa型抗肾癌抗体基因库转染293T细胞后能够在细胞表面表达全长人源抗体,抗体的多样性为下一步筛选特异性抗体奠定良好的基础。

哺乳动物细胞表面展示全长类风湿关节炎抗体库的构建

目的采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源类风湿关节炎抗体库。方法分离类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体全长轻链基因和重链可变区基因,分别插入哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,电击转化感受态大肠杆菌TOPO-10,分别构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库,然后将抗体轻链、重链基因库联合转染293T细胞,用流式细胞仪分析全长人源抗体在293T细胞表面的表达。结果成功构建了类风湿关节炎患者来源的IgG1-Kappa型抗体基因库,随机挑选单克隆经DNA序列分析显示轻链库、重链库的序列正确率分别为80%和60%,可表达的抗体库多样性为6.13×1010。结论类风湿关节炎抗体基因库转染293T细胞后能够在细胞表面表达全长人源抗体,所展示的抗体库具有良好的多样性,能够为下一步筛选特异性抗体奠定基础。

哺乳动物细胞表面展示人源HIV特异性全长抗体库的构建

目的构建人源的HIV特异性全长抗体基因库并获得可稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库。方法提取HIV患者外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体重链可变区(VH)基因,插入哺乳动物细胞表达载体pDGB4,转化感受态大肠杆菌TOPO-10,构建抗体基因库,随后将抗体库的质粒DNA稳定转染FCHO细胞,获得可稳定展示全长抗体的细胞库,用流式细胞仪分析全长抗体在FCHO细胞表面的表达。结果本研究以少量外周血淋巴细胞RNA为来源,构建了库容量为7.77×104的全长抗体基因库;将基因库的质粒DNA稳定转染FCHO细胞后,获得了可稳定展示全长抗体的细胞库;经流式细胞仪分析,有67%的细胞表面可表达可被检测到的全长抗体。结论本研究构建了人源的HIV特异性全长抗体基因库并获得可稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库,为治疗HIV感染的特异性抗体的筛选打下了基础。

采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源膀胱癌特异性抗体基因库

目的构建大容量且能高效展示于哺乳动物细胞表面的全长人源膀胱癌特异性抗体基因库。方法分离膀胱癌患者的外周血单核细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,用RT-PCR方法扩增全套IgG1重链可变区(VH)和Kappa型轻链全长(LCκ)基因,经过相应的限制性内切酶酶切后分别插入pDGB-HC-TM载体,分别构建膀胱癌特异性的抗体重链基因库和轻链基因库(一级抗体库)。随机挑取20个单克隆测定抗体基因序列,并瞬时转染FCHO细胞,结合流式细胞仪检测细胞表面抗体的表达。将上述构建好的轻重链基因库通过4片段连接方法插入双表达载体pDGB4,构建二级抗体库,转染FCHO后用流式细胞仪检测细胞表面抗体表达。结果分别成功构建了膀胱癌特异性的重链基因库和轻链基因库,随机挑取的轻重链单克隆各有7个和9个含有正确的抗体基因编码序列,且能展示于哺乳动物细胞表面,理论库容量达到3.32×10^(11)[(1.7×10~6×70%)×(3.1×10~5×90%)]。成功构建了膀胱癌二级抗体库,库容量为9×10~5。结论利用哺乳动物细胞表面展示技术,我们成功构建了膀胱癌特异性的全长人源抗体基因库,一级抗体库的库容量达到3.32×10^(11),二级抗体库库容量达到9×10~5,为下一步筛选特异性、高亲和力抗膀胱癌抗体奠定了基础。

快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库

目的快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法分离外周血淋巴细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体重链可变区(VH)和全长Kappa型轻链(LCκ)基因库,分别插入载体pDGB-HC-TM,化学转化感受态大肠杆菌DH5α,构建抗体的轻、重链基因库,然后将其联合转染CHO细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在CHO细胞表面的表达。结果构建的非特异性IgG1-Kappa抗体基因库,重链库容量达2.6×105,轻链库容量达2.0×105,理论库容量高达5.2×1010。随机从重链库和轻链库各挑选10个克隆送测序,重链10个克隆的DNA序列分析显示8个含有正确的阅读框架,轻链10个克隆的DNA序列分析显示全部含有正确的阅读框架。流式细胞仪分析显示来自轻链库的10个克隆、重链库的8个克隆均可检测到抗体在CHO细胞表面的表达。用所构建的轻重链抗体库共转染CHO细胞,流式细胞仪分析可检测到抗体在细胞表面的表达,阳性细胞比例达到31.5%,说明所构建的抗体库能够在CHO细胞表面成功展示全长抗体。结论采用本研究建立的哺乳动物细胞展示技术,可在2周内成功构建库容量大且多样性好的全人源抗体基因库,用于高亲和力特异性抗体的筛选。

间质上皮转化因子(c-Met)嵌合抗体重链CDR3随机突变哺乳动物细胞表面展示文库的构建

目的采用哺乳动物细胞表面展示技术构建间质上皮转化因子(c-Met)嵌合抗体3E1D7的重链补体决定区3(CDR3)随机突变抗体库。方法用定向进化的方法在嵌合抗体3E1D7重链CDR3内部造成基因随机突变,将其通过双酶切克隆到哺乳动物细胞展示载体pSZI-CD中构建随机突变抗体库。抗体库基因转染CHO细胞,流式细胞术检测抗体基因是否在细胞表面表达。结果3E1D7重链CDR3随机突变抗体库构建成功,库容量达到5.52×10^6。随机挑选20个阳性克隆进行测序鉴定,20个克隆均在不同位置发生碱基突变且没有重复突变,编码20种不同的氨基酸序列,抗体库具有较好的多样性和随机性。流式细胞术分析抗体基因库上膜情况,均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达。结论通过哺乳动物细胞表面展示技术,成功构建了库容量达到5.52×10^6的c-Met嵌合抗体重链CDR3随机突变抗体库。

哺乳动物细胞表面展示IgG抗体Fc组合突变库的构建及评估

目的·在单点突变文库筛选结果和多个简并引物引入组合突变的基础上,建立一种高效获得高通量的哺乳动物细胞膜表面展示IgG抗体Fc(fragment crystallizable domain)组合突变文库的方法。方法·单点突变文库经流式细胞术分选获得与Fcγ受体IIB(FcγRIIB)高亲和力的位于EU编号233~240位点的氨基酸突变;根据这些突变设计多个简并引物,将引物等比混合或按引物所包含突变多样性占比混合后进行PCR获得含有组合突变的DNA片段;利用重组酶连接片段与载体后转化大肠埃希菌DH5α,获得质粒文库;质粒文库转染Pheonix细胞,制备反转录病毒,然后感染3T3细胞,获得细胞表面表达有Fc突变的细胞文库;使用流式细胞术检测质粒转染Pheonix细胞的效率,以及病毒感染3T3细胞的效率;高通量测序评估质粒文库和细胞文库的构建情况。结果·根据单点突变文库筛选结果,设计32条简并引物,可以覆盖所有期望的组合突变,并且实际文库多样性为期望文库的3.6倍(41600/11520);高通量测序结果显示,相较于引物等比混合获得的质粒文库,按引物所包含突变多样性占比混合所获得的质粒文库具有更好的均一性与完整性,能够覆盖期望文库中99.58%的组合突变类型(11472/11520);一代测序结果显示,10条序列中有3条为期望文库突变,与简并引物设计时计算的多样性相符;流式细胞术的结果显示,Pheonix细胞的转染效率为51.6%,3T3细胞的感染效率为47.4%;高通量测序结果显示,所获得的细胞文库能够覆盖期望文库中85.92%的组合突变(9898/11520)。结论·在已有单点突变文库筛选的氨基酸突变基础上设计多个简并引物,并通过PCR、质粒转染和反转录病毒感染,能够高效、低成本地获得文库覆盖率超过85%的抗体Fc组合突变质粒文库和哺乳动物细胞表面展示文库。

应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库

目的应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库。方法采集登革确诊患者恢复期外周血,分离外周血淋巴细胞并提取其总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库;将抗体基因库转染CHO细胞、用流式细胞仪分析抗体在CHO细胞表面的表达。结果以1.2μg总RNA为模板,用6套引物扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,轻链基因库容量为1.45×104,重链基因库容量为1.8×105;随机挑选的10个轻链克隆和10个重链克隆,经过测序鉴定,轻链有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,重链有7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析含有正确阅读框架的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达,抗体库中可表达的抗体多样性达到109。结论以1.2μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建可表达库容量达到109的登革病毒特异性全长人抗体基因库。

应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建动脉粥样硬化抗体库

目的:利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建动脉粥样硬化(As)抗体细胞库,以寻找动脉粥样硬化治疗性抗体。方法:将载体pcDNA5/FRT改造成双表达载体pcDNA-DHL。分离动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞,提取总RNA,逆转录为cDNA。PCR扩增抗体重链可变区和Kappa型轻链全长,连接至双表达载体pcDNA-DHL,即动脉粥样硬化抗体基因库pDHL-As,将其转染Flp-In TM-CHO细胞(FCHO),流式细胞术检测重组抗体在细胞表面的表达。加入潮霉素筛选出成功转染pDHL-As载体的细胞,即为动脉粥样硬化全长抗体细胞库。结果:成功构建双表达载体pcDNA-DHL。构建的重、轻链初库容量分别达1.79×10^5和1.80×10^5,理论上抗体库多样性为2.32×10^10。动脉粥样硬化抗体库pDHL-As可成功展示在细胞表面,并分选出45个表达抗氧化型低密度脂蛋白抗体的FCHO细胞。结论:本研究成功构建了一个动脉粥样硬化全长人源抗体细胞库。

酿酒酵母表面展示NX1101蛋白酶全细胞催化剂制备火麻多肽

酶解法火麻肽制备具有安全性好、能耗低、营养损失小等优点。研究在综合脱脂火麻仁籽粕蛋白提取以及蛋白水解酶筛选的基础上,以穿梭质粒pYD1为表达载体,将源于牛肠道宏基因组文库中的蛋白水解酶NX1101锚定在酿酒酵母菌株(EYB100)表面,并以此重组菌株作为全细胞催化剂制备火麻多肽。酶学性质分析发现:该全细胞催化剂的最适反应pH值为8.0,在pH 8~10酶活稳定性较高,为耐碱性全细胞催化剂;其最适反应温度50℃,在50℃以下时酶活稳定性较高。脱脂火麻蛋白经表面展示表达NX1101的重组酵母全细胞催化剂酶解后,共获得1095个多肽,其中氨基酸数量≤10的短肽数量达140个。全细胞催化剂酶解效率相较常规酶解技术(以碱性蛋白酶粉剂为对照)增加6.5倍以上。

adw与adr亚型乙型肝炎表面抗原基因在哺乳动物细胞中的表达

以pSV2-dhfr DNA为载体,在其单一酶切点Bg1Ⅱ处分别插入adw或adr亚型的HBVDNA Bg1 ⅡA片段(包括完整的pre-s及s基因),构成PSDHB_(r-1)和PSDHBw重组质粒。将其分别与pX1 DNA用磷酸钙沉淀法共转化LTK-细胞,在HAT培基选择压力下,挑选LTK^+细胞,这些细胞均能有效表达HBsAg。再改用MTX选择培基,并逐渐增加其药量,从MTX抗性细胞中获得稳定表达HBsAg的Mwc-1和Mrm细胞系。

哺乳动物双杂交技术验证HBV表面抗原大蛋白与人胰腺CDK5RAP3蛋白间的相互作用

目的验证HBV表面抗原大蛋白(LHBs)与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内是否存在相互作用关系,为进一步研究HBV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础。方法构建真核表达质粒pACT-CDK5RAP3,哺乳动物双杂交技术验证LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白之间的相互作用。结果实验组和各阴性对照组差别均有统计学意义(P<0.05)。结论LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内存在相互作用关系,且单独转染后没有自身激活作用。

选择适合表达 HBsAg 的哺乳动物细胞系

将含有重组ＨＢｓＡｇ的ｐＭＥＰ４表达性质粒转染ＨｅｐＧ２，ＣＨＯ，Ｃ１２７和ＣＶ１细胞，并用ＥＬＩＳＡ检测表达量，结果在ＨｅｐＧ２细胞中的表达量较高，在Ｃ１２７和ＣＶ１细胞中的表达量偏低，而在ＣＨＯ细胞中没有表达。

细胞表面展示有机磷水解酶的恶臭假单胞菌工程菌的构建及全细胞酶活性分析

利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)冰核基因的N-末端(inpn)作为锚定单元(anchoring mo-tif),通过与来自黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)的有机磷水解酶基因opd构建融合基因inpn-opd,并连接于假单胞菌表达载体pYMBP,然后导入恶臭假单胞菌(P.putida)野生型菌株AB92019,获得了能在其细胞表面展示有机磷水解酶并具有全细胞酶催化活性的重组工程菌MMBL-opd。SDS-PAGE结果表明,融合基因能表达产生80 ku的蛋白质。重组菌MMBL-opd在无抗性LB固体培养基上能稳定生长,所携带的外源质粒的稳定性达到100%;在添加100μmol/L Co2+培养基上28℃培养48 h,表面展示的有机磷水解酶具有最高全细胞酶活性,为0.036 U/mg。用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低92%。重组菌在PBS缓冲液中于4℃条件下保存30 d,仍能保持93%的全细胞酶活。

有机磷水解酶的大肠杆菌细胞表面展示与酶活特性

利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)KCTC1832菌株的冰核蛋白(InaK)的N-末端作为锚定单元和来自黄杆菌(Flavobacterium sp.)ATCC27551菌株opd基因编码的有机磷水解酶作为功能蛋白,构建了一株具有全细胞催化效应的大肠杆菌(Escherichia coli)表面展示工程菌MMBL-405.对该工程菌全细胞有机磷水解酶活性的正交试验结果表明,在诱导物IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导温度为20℃、诱导时间为8 h和Co2+添加浓度为100μmol/L的优化培养条件下,其全细胞酶活性可达到0.62 U/mg细胞干重,是目前国外同类工作所报道酶活性的13.7倍以上.对工程菌所携带的外源质粒在无抗性条件下的稳定性进行了测定,结果表明工程菌经连续转接7次和继代培养168 h后,质粒携载率仍达到60%.

利用酒精酵母细胞表面展示技术制备活疫苗及其潜在应用

最近几年,出现把有关的基因在宿主表达之后的目的蛋白分泌并固定在细菌、病毒和酵母菌细胞表面上的技术—表面展示技术。在这些宿主中,酒精酵母菌是最佳的微生物。本文对利用酒精酵母细胞表面展示技术制备活疫苗的基本原理,在酵母细胞表面展示蛋白质的优点,以及哈维氏弧菌溶血素蛋白在酵母菌细胞表面上展示及其作为活疫苗的潜在应用作了综述。研究结果表明在酒精酵母菌细胞表面上展示的哈维氏弧菌溶血素蛋白在海洋动物中具有很好的免疫原性和免疫保护性。

酵母细胞表面展示的hDAF对补体在酵母细胞表面沉积的抑制作用

目的 :研究酿酒酵母细胞表面展示的人衰变加速因子 (hDAF) ,是否具有天然衰变加速因子的补体抑制活性。方法 :先用正常人血清处理酵母细胞EBY10 0 ,然后用流式细胞仪检测酵母细胞表面C5b 9复合物的沉积和hDAF在酵母细胞表面的表达。结果 :酵母细胞EBY10 0可直接活化人血清中的补体成分 ,导致酵母细胞表面C5b 9的沉积 ;而表达DAF的酵母细胞表面C5b 9的沉积明显减少。结论 :酵母细胞表面展示的DAF可正确折叠 。

利用S-层蛋白在细胞表面展示α-淀粉酶和金属硫蛋白

选用苏云金芽胞杆菌CTC菌株细胞表面S 层蛋白作为表面展示载体 ,利用其N 端信号肽以及锚定序列分别将不同生物特性的外源蛋白带到胞外并锚定在细胞的表面。为研究外源蛋白的分子量和生化特性对表面展示以及对其在细胞表面生物活性的影响 ,选用分子量较大的分泌性蛋白α 淀粉酶和富含半胱氨酸的非分泌性蛋白金属硫蛋白作为目标蛋白。将α 淀粉酶的结构基因 (amy)和金属硫蛋白的结构基因 (smtA)与S 层蛋白的锚定区slh结合 ,构建融合蛋白基因slh amy及slh smtA ,克隆至穿梭载体pHT30 4上 ,得到重组质粒pBMBSA 30 4和pBMBSM 30 4 ;转入带有帮助质粒的重组菌株BMB171 pBMB CSA中 ,得到新的重组菌株BMBSAC和BMBSMC。SDS PAGE显示融合蛋白SLH AMY和SLH SMTA在重组菌的表面得到了表达。利用锥虫蓝染色 打孔加膜法表明重组菌SAC的确具有表面酶活性 ,α 淀粉酶被固定在细胞表面。碘液法测定的数据表明重组菌SAC的菌悬液样品较之受体菌BMB171菌悬液样品酶活提高了 4 2 4 %。Ni NTA 琼脂糖微球吸附试验显示重组菌SMC能够被微球所吸附 ,证实SMTA在重组菌表面具有活性。对游离镉离子的吸附试验显示重组菌对镉离子的吸附能力是对照受体菌的 4倍。

酵母细胞表面展示技术

酵母细胞表达体系具备较为完善的蛋白质翻译后修饰和分泌的机制。以酵母为基础的细胞表面展示技术是一项新兴的真核蛋白展示技术,已成功应用于蛋白质识别、蛋白质的固定化和定向进化研究,成为了蛋白质工程研究的重要工具。根据与酵母细胞壁的外源目的蛋白融合部位的不同,酿酒酵母表面展示系统主要分为凝集素系统和絮凝素系统2大系统。将该技术引入动物营养研究领域,有望通过诱导宿主产生原虫或甲烷菌的抗体,对瘤胃微生态进行调控,从而以减少甲烷排放;生产高活性的全细胞催化剂,以提高反刍动物和单胃动物对纤维物质的利用效率。为此,本文就该技术的原理、特点和应用领域进行了综述。

海洋哈维氏弧菌溶血素蛋白在酵母菌细胞表面上的展示及其活性的测定

为制备以酒精酵母为载体的基因工程疫苗，参照其Genbank中基因序列设计一对引物，PCR扩增得到预期长度的产物，双酶切插入用于酒精酵母表面展示的穿梭质粒载体pYD1，转化大肠杆菌TOP10，提取阳性质粒转化酒精酵母菌株EBY100，诱导表达后，用免疫荧光和流式细胞仪检测外源蛋白的表达，结果测得最佳诱导时间为36～48h，诱导培养后约30．0％左右的酵母细胞表达外源蛋白；同时以EBY100和转空质粒的酵母菌株为对照，测得诱导培养后的阳性酵母转化株的细胞对牙鲆鱼血细胞具有溶血活性，以此酵母活细胞分设高中低三个浓度组，腹腔注射养殖牙鲆幼鱼，检测其毒性，结果表明此重组酵母对牙鲆是安全的。该研究为下一步鱼用活载体疫苗免疫效果的研究奠定了基础。