哺乳动物细胞表达系统研究进展

哺乳动物细胞表达系统具有强大的翻译后修饰功能,表达的重组蛋白更接近人源构象,因此被广泛用于治疗性重组蛋白的生产,其中应用最广泛的是中华仓鼠卵巢细胞。基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等研究的不断深入促进了哺乳动物细胞表达系统的不断完善。本文立足于哺乳动物细胞表达系统的研究现状,对表达载体的优化、宿主细胞和位点特异性重组等方面的最新进展进行综述。

一株针对人EGFR的单链抗体克隆与哺乳细胞表达

目的：制备特异性抗人表皮生长因子受体（EGFR）的单链抗体（sc Fv）,鉴定其生物学活性,为进一步研究基于单链抗体的免疫治疗奠定基础。方法：从分泌抗人EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞系提取总RNA,利用5’RACE技术扩增轻链和重链可变区（VL、VH）基因,构建具有VL、VH基因的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到真核细胞表达载体pc DNA3.1中进行表达和鉴定。ELISA鉴定单链抗体对抗原的特异性;Fortebio检测抗原抗体间的亲和力,流式细胞术检测单链抗体结合肺癌细胞系天然EGFR的功能活性。结果：获得唯一的轻重链可变区序列VL、VH,成功构建EGFR-sc Fv,特异性与天然EGFR蛋白结合,亲和力达3.22×10-9mol/L。结论：成功构建了抗人EGFR单链抗体,为肺癌免疫导向治疗研究奠定了基础。

哺乳动物细胞高效表达系统研究进展

哺乳动物细胞高效表达系统是基因工程制药研究中的一个重要内容,而表达载体和宿主细胞是哺乳动物细胞表达系统的2个基本组成部分。近年来通过降低目的基因的位置效应、提高目的基因的转录和翻译水平以及目的基因的拷贝数等方面构建哺乳动物细胞高效表达载体。与此同时,研究者也对宿主细胞进行了多方面的改造,使之能更好地适应工业化大规模培养的要求,从而降低细胞培养和产品纯化的成本。本文就哺乳动物细胞高效表达载体的构建及宿主细胞的改造等方面的最新进展作一简述。

禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白的哺乳动物细胞表达系统表达及鉴定

利用哺乳动物细胞表达系统对禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白进行表达,并检测所表达融合蛋白的抗原性。首先将N基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组真核表达载体,然后将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜检测N蛋白的表达,并用Western blot检测表达蛋白的抗原性。结果显示,禽偏肺病毒核衣壳N蛋白主要表达在细胞浆中,在转染后48h后表达量最高;与抗N蛋白抗体有抗原性,所表达核衣壳N融合蛋白大小为72kDa左右,与预期结果一致。结论,本试验成功应用哺乳动物表达系统表达了禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白,表达蛋白具有抗原性,为与禽偏肺病毒核衣壳N蛋白的相关研究奠定了基础。

用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达新技术

近年来,用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达领域涌现出一系列革命性的新技术。优化的工程细胞为表达重组蛋白提供了优良的宿主;基于荧光的筛选方法可以快捷地得到高表达细胞株;高通量的培养工艺能够预测适合外源蛋白表达的细胞培养条件;可抛弃式生物反应器为大规模细胞培养提供了更多的选择;大规模瞬时表达技术节省了重组蛋白的生产时间。这些新技术提高了重组蛋白的研发和生产效率,加快了蛋白药物的工业化进程。

哺乳类细胞基因表达系统

真核基因的转录和转译调控是哺乳类细胞基因表达系统建立和发展的基础,外源基因的表达水平不仅决定于启动子/增强子的强弱,还与剪接信号、终止信号和poly(A)信号以及质粒的拷贝数等因素有关。另外,在基因治疗的研究中,也已寻找到多种具有组织或肿瘤特异性的启动子,来达到特异性肿瘤基因治疗的目的。

Prosaposin基因哺乳动物细胞表达质粒的构建及稳定转染细胞系的建立

目的构建前凋亡因子prosaposin的哺乳动物细胞表达质粒,转染NIH3T3细胞,建立稳定转染prosaposin的细胞系。方法采用PCR方法扩增prosaposin的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc抗原表位标签,共同克隆至pcDNA3.1(+)哺乳动物细胞表达载体中,构建pcDNA-Psap-Myc融合表达质粒。用脂质体将经过验证、测序的pcDNA-Psap-Myc质粒转染NIH3T3细胞,通过G418筛选建立稳定过表达prosaposin的NIH3T3细胞系。采用RT-PCR和western blotting方法,检测prosaposin在稳定转染的NIH3T3细胞系中的表达。结果成功构建了pcDNA-Psap-Myc融合表达质粒,建立了稳定过表达prosaposin的NIH3T3细胞系。RT-PCR和Western blotting结果表明,构建的稳定细胞系中成功表达prosaposin-Myc融合蛋白。结论Prosaposin哺乳动物细胞表达质粒的成功构建和稳定转染NIH3T3细胞系的建立,为进一步体外研究prosaposin蛋白的功能及其与其他分子间的相互作用奠定了基础。

破骨细胞分化因子哺乳类荧光蛋白融合表达载体的构建与序列鉴定

目的 :为了用基因工程表达重组人破骨细胞分化因子 (ODF)可溶性功能片段 ,构建哺乳动物细胞表达载体。方法 :PCR扩增人ODF基因cDNA功能活性片段 ,利用拓扑酶连接入哺乳动物细胞表达载体 pcDNA3.1/CT -GFP -TOPO ,转化E.coliTOP10感受态细胞 ,氨苄青霉素筛选阳性克隆 ,提取质粒进行酶切分析和测序分析。结果 :成功克隆了人ODF基因cDNA功能片段。结论 :载体构建成功 。

重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达

目的研究重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的表达。方法用RT-PCR法从人胎肝中克隆出人蛋白C轻重链基因,用PCR突变法获得人活性蛋白C的全基因,将所得全基因连接入哺乳动物细胞表达载体,并转染293细胞研究其表达和活性。结果成功得到重组人活性蛋白C基因,并成功构建哺乳动物细胞表达载体和转染293细胞获高效表达以及相关活性数据。结论通过以上方法可以获得重组人活性蛋白C基因,并实现了在哺乳动物细胞中的高效表达。

通过高表达Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合使CHO细胞适于在无蛋白培养基中抗凋亡培养

哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中 ,哺乳动物细胞生长活力差 ,且容易发生细胞凋亡 ,因而难以大规模培养。为解决此问题 ,应用双顺反子表达载体在CHO dhfr- 细胞中同时表达Igf 1 Bcl 2或Bcl 2 CyclinE基因组合 ,通过Bcl 2使细胞获得抗凋亡能力 ;通过Igf 1或CyclinE促进细胞生长分裂 ,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO dhfr- 细胞 ,应用Westernblot从G4 18抗性克隆中分别筛选到Bcl 2高表达克隆若干个 ,对其中表达Bcl 2最高的CHO IB3和CHO BC1做进一步Westernblot和流式细胞分析 ,确认此两个细胞株分别高表达Igf 1 Bcl 2和Bcl 2 CyclinE基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡 ,并以流式细胞术和DNALadder法检测细胞凋亡 ,证明CHO IB3和CHO BC1均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO dhfr- 对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明 ,CHO IB3和CHO BC1在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHO dhfr- 对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长 ,适于作为生物工程宿主细胞。

构建稳定表达病毒相关RNA的真核细胞株及其对抗肿瘤免疫促凋亡分子的影响

目的:构建稳定表达病毒相关RNA(virus-associated RNA,VA RNA)的293F-VA细胞株,并探讨其对靶向HER2阳性肿瘤的免疫促凋亡分子表达水平的影响。方法:采用PCR方法,扩增含VA RNA的功能序列,克隆入Piggy Bac转座系统质粒,将VA RNA编码序列转入293F细胞中,经过抗性筛选和流式细胞仪鉴定,得到293F-VA细胞株。将萤光素酶、红色荧光蛋白及免疫促凋亡分子编码质粒分别转入293F-VA细胞株或亲本293F细胞株,通过萤光素酶活力检测和Western Blot实验,比较两种细胞株对外源目的蛋白表达水平的影响。结果:成功构建了Piggy Bac-VA质粒。共转染Piggy Bac-VA质粒可以明显提高细胞内Fluc蛋白的表达水平(P <0. 05)。VA RNA编码序列通过Piggy Bac转座系统转入293F细胞中,获得293F-VA细胞株。与293F亲本细胞相比,293F-VA细胞株将萤火虫萤光素酶Fluc蛋白的表达水平提高363. 9%(P<0. 05);对海肾萤光素酶Rluc蛋白及红色荧光蛋白m Cherry的表达均表现出3倍左右的提高(P <0. 05)。293F-VA细胞株不仅能够提高免疫促凋亡分子e23-Fc-Fdt-t Bid在细胞内的表达水平,并且显著增加目的蛋白向细胞外分泌的水平,较293F亲本细胞提高4. 2倍(P <0. 05)。结论:建立了稳定表达VA RNA的细胞株293F-VA,该细胞株能够显著提高抗肿瘤免疫促凋亡分子的表达水平。

柠檬酸铁铵对悬浮HEK293细胞转染的影响机制探究

基于聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的悬浮人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)转染技术前景广阔,但培养基组分会影响转染效率。简单的离心换液存在污染风险,且影响细胞状态。探究抑制转染效率的关键组分对转染过程的影响机制,有利于从根本上解决该问题。首先通过探究培养基中对转染效率具有潜在影响的组分确定关键组分柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)的抑制作用,然后通过考察柠檬酸铁铵添加对细胞状态、PEI与DNA形成的复合物(PEI-DNA complex,PEI-DNA复合物)结合情况、目的基因表达情况的影响,分析其抑制转染效率的机制。结果表明,高浓度的柠檬酸铁铵对细胞转染存在明显抑制作用,且该抑制作用随着柠檬酸铁铵浓度的升高而逐渐增强。当柠檬酸根和铁离子同时存在时才会抑制细胞转染过程。过高浓度的柠檬酸铁铵使PEI-DNA复合物的粒径显著增加,复合物进入细胞更加困难,导致进入细胞的复合物数量减少,最终引起细胞转染效率的大幅下降。柠檬酸铁铵通过影响PEI-DNA复合物的大小限制DNA进入细胞,从而抑制PEI介导的悬浮HEK293细胞转染过程。控制转染时柠檬酸铁铵浓度在20μmol/L内可解决其对转染过程的抑制作用。本研究深入认识了柠檬酸铁铵对PEI介导的悬浮HEK293细胞转染过程的影响及其机制,为悬浮HEK293细胞转染培养基的开发和理性设计提供有力参考。

几种外源基因真核表达体系研究进展

随着分子生物学的飞速发展,进入到后基因组时代后,人们对蛋白质的结构和功能研究越加深入,对蛋白质表达载体的研究也逐渐丰富.本文主要综述了几种常见的真核表达载体以及影响外源基因在这些载体中表达效率的一些因素,旨在对研究者有所启发.

富含GC的DNA片段在哺乳动物细胞基因超高表达调控中的重要作用

通过在结构基因或基因启动子的5’和/或3’端加入天然1.006kb或人工合成0.733kb的富含GC的DNA片段(包括内含子),所构建的稳定表达载体在实验室规模实现了20多种蛋白质在哺乳动物细胞中超高表达.该实验提供了证据表明,非编码的富含GC的DNA片段(包括内含子)是一种超级"染色质开放元件",在哺乳动物细胞基因表达中起关键作用.实验还进一步表明,哺乳动物细胞的基因表达调控在染色质水平主要与DNA的一级结构,即DNA的GC含量有关.

启动子上的增强子和CpG岛在转基因沉默和位置效应中的作用

目的探讨哺乳动物细胞表达载体启动子上增强子和CpG岛调控元件在转基因沉默和位置效应中的作用。方法应用带增强子的八聚体结合转录因子4(OCT4)基因启动子、带CpG岛的性别决定区Y框蛋白2(SOX2)基因启动子、带增强子和CpG岛的巨细胞病毒(CMV)基因启动子以及不含近端增强子和CpG岛的NANOG基因启动子构建哺乳动物细胞表达载体,并分别转染中国仓鼠卵巢细胞株CHO-K1细胞和人胚胎肾细胞(HEK293)。应用Image J软件中Mean算法计算OCT4、SOX2、CMV和NANOG基因启动子在CHO-K1细胞和HEK293细胞介导的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达的荧光强度,应用Image J软件中Mininum、Maxentropy、Mean 3种算法分别计算OCT4、SOX2、CMV和NANOG基因启动子4种载体稳定转染CHO-K1细胞后形成的多个单细胞克隆混合生长样品在同一个样本中最大荧光强度的细胞、大于平均荧光强度的所有细胞和最小荧光强度的所有细胞的EGFP平均荧光强度;应用有限稀释法从G418筛选后获得的稳定转染的多个单克隆混合的CHO-K1细胞中,分别筛选含EGFP的pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog质粒稳定转染CHO-K1细胞的单克隆细胞,每个质粒载体随机筛选3个单克隆细胞,应用Image J软件分析EGFP平均荧光强度;应用酶联免疫吸附法检测转染第20、30天CHO-K1细胞中EGFP蛋白表达水平,应用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测转染第20、30天CHO-K1细胞中EGFP mRNA表达水平。结果SOX2基因启动子在CHO-K1细胞和HEK293细胞中介导表达的EGFP平均荧光强度比较差异无统计学意义(t=0.770,P>0.05)。OCT4、CMV、NANOG基因启动子在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP平均荧光强度显著高于HEK293细胞(t=7.000、11.100、4.900,P<0.05)。SOX2基因启动子于转染第20、30天在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP蛋白水平比较差异无统计学意义(t=0.330,P>0.05)。CMV基因启动子于转染第20天在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP蛋白水平显著低于转染第30天(t=3.770,P<0.05);OCT4基因启动子于转染第20、30天在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP蛋白水平比较差异无统计学意义(t=2.500,P>0.05);NANOG基因启动子于转染第20、30天在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP蛋白表达水平比较差异无统计学意义(t=0.014,P>0.05)。转染第20天与转染第30天SOX2、CMV、NANOG基因启动子在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP平均荧光强度值比较差异均无统计学意义(t=0.130、0.830、0.210,P>0.05);转染第30天,OCT4基因启动子在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP平均荧光强度值显著低于转染第20天(t=5.750,P<0.05)。SOX2、CMV、OCT4、NANOG基因启动子在CHO-K1细胞中介导表达的EGFP蛋白水平比较差异无统计学意义(F=4.070,P>0.05)。CMV、OCT4、NANOG基因启动子在CHO-K1细胞中介导的EGFP mRNA相对表达量显著高于SOX2基因启动子(t=5.440、5.000、5.740,P<0.05);CMV、OCT4基因启动子在CHO-K1细胞中介导的EGFP mRNA相对表达量显著高于NANOG基因启动子(t=3.220、4.270,P<0.05);CMV基因启动子在CHO-K1细胞中介导的EGFP mRNA相对表达量高于OCT4基因启动子,但差异无统计学意义(t=1.270,P>0.05)。SOX2基因启动子介导表达的EGFP在转录水平和转录后水平差异最大(t=16.900,P<0.05);NANOG基因启动子介导表达的EGFP在转录水平和转录后水平差异次之(t=14.930,P<0.05);OCT4和CMV基因启动子介导表达的EGFP在转录水平和转录后水平差异最小(t=2.060、0.430,P>0.05)。应用Mininum、Maxentropy、Mean 3种算法计算OCT4基因启动子在多克隆下介导表达的EGFP的荧光强度比较差异无统计学意义(F=3.720,P>0.05),SOX2、CMV和NANOG基因启动子在多克隆下介导EGFP表达的荧光强度比较差异均有统计学意义(F=516.400、428.500、28.120,P<0.05)。不同单克隆细胞中的差异分析显示,4种载体在不同单克隆细胞中介导表达的EGFP荧光强度值的标准误差相比,从高到低依次为NANOG基因启动子在不同单克隆细胞中介导表达的EGFP荧光强度值标准误差、SOX2基因启动子在不同单克隆细胞中介导表达的EGFP荧光强度值标准误差、OCT4基因启动子在不同单克隆细胞中介导表达的EGFP荧光强度值标准误差、CMV基因启动子在不同单克隆细胞中介导表达的EGFP荧光强度值标准误差,且OCT4基因启动子与SOX2、CMV基因启动子在单克隆细胞中介导表达的EGFP平均荧光强度比较差异有统计学意义(t=3.070、4.360,P<0.05)。结论带CpG岛的启动子能在转录后克服转基因沉默效应,带增强子的启动子具有克服位置效应的作用;二者的恰当组合可用于设计在哺乳动物细胞中高效稳定表达的启动子。

乙肝基因工程疫苗研制成功并投产

中国预防医学科学院病毒研究所、中国科学院上海生物化学研究所、卫生部长春生物制品研究所、卫生部北京生物制品研究所、中国药品生物制品检定所的研究人员。

外源基因表达系统的研究进展

随着DNA重组技术的发展,外源基因的表达问题受到越来越多的关注。常用的外源基因表达系统有原核表达系统和真核表达系统,两种表达系统各有优缺点。本文主要对这两类表达系统的研究进展、存在问题等做一概述。

B型流感病毒血凝素的表达及免疫原性测定

B型流感病毒是引起季节性流感的原因之一,严重时会造成重大疾病或死亡。为了检测B型流感病毒2个疫苗候选毒株的血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白胞外段在哺乳动物细胞中的表达及在小鼠体内的免疫原性,本研究将带有三聚体标签的HA胞外段(HA-ectodomain,HA-ecto)序列及神经氨酸酶(neuraminidase,NA)全长编码框经密码子优化后构建至pCAGGS载体中,通过线性聚乙烯亚胺将pCAGGS-HA-ecto与pCAGGS-NA共转染293T细胞。收集转染后96h的上清,通过镍离子亲和层析及分子筛层析获得三聚体形式的HA-ecto蛋白,然后将HA-ecto三聚体蛋白免疫小鼠,进行酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HAI)检测HA-ecto蛋白诱导小鼠后产生的抗体水平。纯化结果显示,通过哺乳动物细胞表达系统能够得到分泌型表达的三聚体HA-ecto蛋白。ELISA及HAI结果显示,三聚体HA-ecto蛋白二次免疫小鼠后,能诱导小鼠产生较高水平的同源和异源交叉抗体。以上结果表明,哺乳动物细胞表达的B型流感病毒HA蛋白可作为亚单位重组流感疫苗的候选。

突变型人源乙酰胆碱神经受体α7的构建表达纯化

为增强神经型乙酰胆碱受体(n AChR)蛋白的稳定性和表达量,以满足晶体学研究的要求。根据同源蛋白的氨基酸序列比对结果,设计了胞内5个切除位点,设计合适的引物,利用分子克隆的方法扩增出相应的改造后c DNA序列并构建到BacMam表达载体,最后利用BacMam杆状病毒表达系统构建表达突变型重组杆状病毒,并转染到HEK293F哺乳动物细胞中,诱导表达重组蛋白。采用免疫印迹法小规模表达检测后,选取合适突变型进行表达,并利用MBP亲和层析和分子排阻法进行两步纯化后,通过电子显微镜负染技术检测纯化后的蛋白质量。结果显示,成功克隆并表达了乙酰胆碱神经受体α7的5种不同的胞内区域突变型,且蛋白表达量与野生型相比均有所提高,其中P5突变型表达量最高。经表达纯化后,能够获得毫克级别的乙酰胆碱受体蛋白,并且电子显微镜观察的结果表明蛋白呈现出相对稳定的五聚体形貌,大小尺寸与理论相符。