基于体温扩增的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种3种可视化快速检测方法的建立

为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM基因序列设计和筛选了ERA检测引物和探针,分别建立ERA显色法、荧光法、试纸条法3种可视化快速检测方法,并评估其特异性和灵敏度,以及在市售样品检测适用性和准确性。结果显示,建立的方法对3株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均有扩增,其他常见的食源性致病菌以及其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均无扩增,说明检测方法的特异性良好。3种方法的检出限均为10^(-2)ng/μL,灵敏度较好。采用建立的3种可视化快速检测方法对15份市售样品进行检测,检出阳性2份,检出率为13.3%。该结果与国标方法的检测结果一致,说明方法具有较好的适用性和准确性。本研究建立的基于体温扩增技术的显色法、荧光法和试纸条法具有较高的特异性及灵敏度,37℃体温扩增15 min左右即可获取检测结果,且裸眼可视,可为食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种的现场可视化快速筛查提供新型简便的策略。

食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌实时荧光PCR检测的研究

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的核酸检测方法。方法:根据16S~23S rRNA基因片段序列,利用Oligo7设计TaqMan探针及引物,并验证实时荧光PCR检测方法的特异性和灵敏性。结果:用实时荧光PCR检测方法检测15株标准菌株,只有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌呈阳性,验证了此方法具有良好的特异性。灵敏度实验中得出菌液灵敏度为5.8×10~2 CFU·mL^(-1),DNA灵敏度为7.2×10^(-4) ng·μL^(-1)。结论:建立的实时荧光PCR检测方法有良好的特异性和灵敏度,该方法可用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测,具有较好的应用价值。

1株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在湿米粉中的产毒规律分析

目的:了解防腐剂(脱氢乙酸、ε-聚赖氨酸盐酸盐)和培养温度对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在湿米粉培养基上生长及产毒的影响。方法:以1株自食物中毒事件样品中分离得到的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)菌株为研究对象,分别接种至添加脱氢乙酸(1.0 g/kg)、添加ε-聚赖氨酸盐酸盐(0.25 g/kg)以及未添加防腐剂的湿米粉培养基中,置于10,26,36℃条件下培养,研究其在湿米粉中生长及产毒情况。采用修正的Gompertz模型构建初级生长模型。结果:在10℃条件下该菌生长缓慢且未产生米酵菌酸;在26℃条件下培养至96 h,该菌对照组和各试验组产生的毒素均超过500μg/kg,在添加脱氢乙酸的样品中最早产生米酵菌酸,其最高质量浓度(1 484μg/kg)略低于对照组(2 561μg/kg)和ε-聚赖氨酸盐酸盐组(2 762μg/kg);在36℃条件下该菌生长最为快速,各组产毒量均低于350μg/kg。结论:湿米粉在10℃贮存可有效降低产生米酵菌酸的风险,脱氢乙酸、ε-聚赖氨酸盐酸盐均未能阻止唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长和产毒,需进一步探索能起作用的防腐剂,制定多手段结合的控制措施。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌致病变种的危害及预防

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌致病变种是导致木耳、银耳、酵米面等食物中毒的病原菌,但目前媒体对该菌名称的使用较为混乱,对中毒防治和科普等工作造成了干扰。通过对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌致病变种的分类和名称演变进行梳理,并对其致病危害及主要预防措施进行了综述,以期为该致病菌引发的食物中毒预防工作提供理论指导。

云南省一例唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)食物中毒事件调查分析

目的调查分析云南省一例唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)食物中毒事件。方法参照GB/T4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》对样品进行唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检测。按照GB 5009.189-2016《食品安全国家标准食品中米酵菌酸的测定》检测样品中的米酵菌酸,采用液相色谱法对样品进行检测。用VITEK 2COMPACT全自动微生物生化鉴定仪和飞行时间质谱进行微生物鉴定。结果2份样品鉴定结果为唐菖蒲伯克霍尔德菌。2份样品均检测出米酵菌酸,含量分别为18.0和24.2 mg/kg。结论本次食物中毒源于食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)污染。

唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种污染调查及其生长与产毒特性分析

唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病种(Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans,BGC)是迄今我国发现的发病率和死亡率最高的食源性致病菌。为调查广州市市售湿米面制品、银耳及木耳中BGC的污染状况,同时掌握在不同培养条件下BGC的生长与产毒规律,依据GB 4789.29-2020对100份食品样品进行定性分析;通过测定BGC菌株在各培养条件下菌液的OD600值和毒素含量,分析了不同的温度、时间、pH及NaCl浓度下BGC的生长状况与产毒能力。结果表明,100份食品样品中共检出1份(湿木耳)BGC阳性样品,污染率为1%(1/100);BGC的生长与产毒受培养基的影响较大,碱性(pH值为9.5~10.5)与一定渗透压(NaCl质量浓度为0.02~0.04 g/mL)环境下,BGC在马铃薯葡萄糖水中能生长,而在脑心浸液肉汤中几乎不生长,BGC在马铃薯半固体琼脂中的产毒量(231.24μg/mL)远大于BHI半固体琼脂和LB半固体琼脂;BGC适宜生长和产毒的温度为20~37℃、适宜pH值为4~8.5,其中最适生长温度与pH值分别为37℃、6.0,最佳产毒温度与pH值为30℃、7.0;BGC在低温(4~15℃)下仍能存活,且有少量的毒素产生(2.11μg/mL);当NaCl质量浓度为0.005 g/mL时,产毒量从未添加前的139.80降至52.27μg/mL,达到0.04 g/mL时,产毒为0。结果提示,广州市市售木耳中存在BGC污染的风险,在食品加工或贮存过程中添加一定浓度的NaCl可减少由BGC引起的食物中毒。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌三种鉴定方法的比较

以食品及环境样品中初步分离的13株疑似唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)为研究对象,通过比较生理生化检测法、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法和rec A序列分析法,得到快速准确鉴定唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的方法。结果表明,13株疑似菌株经MALDI-TOF-MS法和rec A序列分析法鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,而VITEK 2 COMPACT生理生化法鉴定8株(62%)为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,其他5株为栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)。在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的鉴定方法中,MALDI-TOF-MS法和rec A序列分析法鉴定结果一致且准确,而VITEK 2 COMPACT生化检测法存在缺陷。相比传统生理生化鉴定方法,MALDI-TOF-MS法和rec A序列分析法在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌鉴定中更为快速、准确。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的研究进展

文章对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)命名历程、生物学特性、污染食品中毒作用机理、消毒和去毒及预防中毒措施等方面内容进行了综述,并展望了未来研究的方向。

浅谈唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的危害

近年来,由于误食用被唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)污染的食品引发的中毒事件频繁发生,引起社会的强烈关注,该菌产生的真菌毒素——米酵菌酸是引起食物中毒事件的真正原因。本文对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的发现、生物学特性、致病危害及预防中毒等方面进行综述,为相关食品安全监管提供参考。

唐菖蒲伯克霍尔德菌产毒差异菌株菌体脂肪酸分析

为了探讨脂肪酸与椰毒假单胞菌米酵菌酸毒素产生之间的相关性,采用气相色谱和面积归一法分别对产毒差异菌株的菌体脂肪酸进行分离和定量分析。结果显示,9株菌株共分离到11种组分,其中十六碳酸(C16:0)、顺-10-十七碳一烯酸(C17:1)以及顺,顺-9,12-十八碳二烯酸(C18:2n6c)含量较高,平均含量依次为43.85%、25.84%和14.75%。培养基及培养温度是影响脂肪酸组成的主要因素,相同培养条件下,9株菌株菌体脂肪酸组成相似度达90%以上。毒性试验后,不产毒菌株10574与产毒菌株菌体脂肪酸均发生相似变化,即顺-9-十八碳一烯酸(C18:1n9c)含量降低,而顺,顺-9,12-十八碳二烯酸(C18:2n6c)含量升高。生长条件是影响菌体脂肪酸组成的主要因素,脂肪酸与椰毒假单胞菌米酵菌酸产生的相关性不大。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种环介导等温扩增荧光方法的建立

【目的】建立一个基于环介导等温扩增与荧光探针结合的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)特异性检测方法。【方法】通过多重序列比对分析,选择B.gladioli pv.cocovenenans共有的bonA为靶位点,设计环介导等温扩增的特异性引物和荧光探针,通过19株B.gladioli和3株非目标菌株,验证该方法的特异性。将该方法的检测特异性与现有的基于实时荧光定量PCR鉴定B.gladioli pv.cocovenenans的方法进行比较,并对建立的方法进行灵敏度探究。【结果】建立的环介导等温扩增荧光鉴定方法对B.gladioli pv.cocovenenans具有特异性,能在30 min内得出结果,且该方法能进行可视化直接观测。该方法的基因组DNA最低检测限度为1.98 pg/μL,检测灵敏度为2.7×102 CFU/mL。另外,该方法能应用到食品样品中B.gladioli pv.cocovenenans的检测。【结论】本研究建立了一个快速、可视化、特异性强的检测方法,能有效用于B.gladioli pv.cocovenenans的快速筛查,为保障食品安全提供了一种快速、准确的分子检测手段。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型实时荧光PCR方法的建立

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)的实时荧光PCR方法。方法:根据唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14的米酵菌酸生物合成基因bonM序列,用Primer Premier 6设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立了实时荧光PCR反应体系。通过对5株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株及14株其他菌株进行实时荧光PCR检测,验证该方法的特异性。同时从菌液浓度和DNA浓度水平上进行研究,确定该检测方法的灵敏度。并同时采用该方法和GB 4789.29—2020,对155粉湿米粉及其原料大米进行检测,验证该方法的实用性。结果:实时荧光PCR方法特异性检测结果显示,5株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均扩增阳性,其他菌株均扩增阴性。通过灵敏度试验,确定该方法检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的菌液检测灵敏度为6.5×10^(2)cfu/mL,DNA检测灵敏度为4.8×10^(-4)ng/μL。实际样品的检测结果显示,采用该方法进行检测,2份湿米粉和3份大米PCR检测阳性,其余150份样品均为阴性,这与采用GB 4789.29—2020检测的结果一致,验证了该检测体系的实用性。结论:文章建立的实时荧光PCR检测方法,反应时间仅需1 h,设计的引物和探针具有较高的特异性及灵敏度,能够有效地用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的快速筛查,这为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的检测提供了一种简便、快速、准确的分子检测手段。

2005—2020年我国唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中毒事件流行病学分析

目的 分析2005—2020年我国唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中毒流行病学特征和规律,为预防唐菖蒲伯克霍尔德氏菌导致的酵米面中毒提供科学依据。方法 收集2005—2020年全国唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中毒事件,对事件相关资料进行回顾性的描述性分析,应用Excel 2013软件和SPSS 26.0软件进行统计学分析。结果 2005—2020年,全国共报告唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中毒事件30起,中毒188例,死亡85例,病死率为45.21%;其中较大级别事件占事件总数的93.33%(28/30),病死率53.13%。临床主要表现为呕吐、腹痛、头晕、腹泻。主要发生在5~9月;全国有7个省份22个县报告唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中毒事件,主要位于我国华南、西南和东北地区。人群各个年龄段均有发病,病死率随年龄增加呈上升趋势。引起中毒事件的主要中毒食品有谷类食品和木耳;谷类食品中,家庭自制的谷类发酵制品占80.00%华南和西南地区以玉米粑、糯玉米汤圆、河粉等食品为主,北方地区以酸汤子为主。结论 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中毒事件,因其高病死率往往引起社会的重视。2005—2020年,除2013、2017和2019年外,其他年份唐菖蒲伯克霍尔德氏菌引起的中毒事件均有报告。事件发生地区主要为农村地区,以家庭自制的谷类发酵食品为主,近年来发生在城市地区由市售食品河粉引起中毒事件应引起高度重视。预防唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中毒事件主要从食品加工方式和饮食习惯等环节进行规范管理,提倡科学饮食,提高食品安全意识。

唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种食物中毒分离株的遗传特性研究

目的对1株引起聚集性米酵菌酸中毒的生吊面浆食品样品分离株唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)DBJ进行全基因组测序并分析,解析菌株产毒及致病的基因特征。方法提取唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种DBJ基因组DNA,对菌株进行测序获得全基因组完成图,利用生物信息学分析手段对序列进行挖掘分析。结果菌株DBJ基因组由两个染色体(G1和G2)和一个质粒(P)组成,其中两个染色体大小均为4 Mb左右,质粒大小约为300 kb。两个染色体的GC含量也相仿,约为68.0%,质粒则稍低为63.0%。进一步分析发现,G2染色体上存在产米酵菌酸的bon基因簇。遗传进化分析后发现,菌株DBJ在亲缘关系上与加拿大玉米分离株UCD-UG_CHAPALOTE最为接近,两株菌处在同一进化分支。且255株菌种中有31株携带bon基因簇的菌株,较不携带该基因的唐菖蒲伯克霍尔德菌有明显遗传进化倾向。结论唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种DBJ分离株基因组中携带产米酵菌酸的bon基因簇,是引起食物中毒的主要原因。

一种固氮菌-唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的表型特征

目的对与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和椰毒伯克霍尔德氏菌有关的4株重要的菌株进行表型性状描述,以证明它们是同一个菌种。方法着重用传统的底物利用试验和GC及专用软件(Sherlock系统6.1)分析菌细胞的脂肪酸,做全面的表型描述。结果 4株菌的30项生化反应完全一致,170项底物利用试验95%一致,12种脂肪酸及脂肪酸组合基本一致;4株菌都是固氮菌。结论 4个株菌为同一个菌种,都可称为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。

唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14毒力相关基因解析

目的了解1株引起致死性食物中毒事件的唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14的全基因组序列特征,对其基因组中米酵菌酸(BA)和毒黄素(TF)的生物合成相关基因进行了预测和分析。方法通过第三代高通量测序技术(PacBio)对Co14进行全基因组测序,使用BLAST软件预测BA和TF的生物合成相关基因。结果 Co14基因组中含有2个闭合的环状染色体,大小分别为4.1和4.0 Mb,鸟嘌呤和胞嘧啶所占比例(GC含量)分别为67.82%和68.32%。Co14基因组中还携带有一个146 kb的闭合环状质粒,GC含量为63.25%,编码149个基因。通过同源序列比对,在Co14染色体1上发现了BA和TF的生物合成相关基因簇bonR1R2LJKFGABDEHIM和toxRABCDE。结论 Co14全基因组数据为研究唐菖蒲伯克霍尔德菌食物中毒菌株的致病性和毒力因子产生机制奠定了遗传学基础。

唐菖蒲伯克霍尔德菌米酵菌酸生物合成机制

2018年中国暴发了多起由唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种引起的食物中毒事件,并有多例重症和死亡病例出现,给食品安全和人民健康造成了严重危害。该菌代谢产生的米酵菌酸是引起食物中毒和死亡的元凶。本文综述了唐菖蒲伯克霍尔德菌引起食物中毒的特征、米酵菌酸生物合成机制以及米酵菌酸产生的环境应答,展望了唐菖蒲伯克霍尔德菌米酵菌酸生物合成机制的研究前景。

松材线虫对其携带的一株细菌繁殖和致病性的影响

采用黑松(Pinusthunbergii)无菌苗和愈伤组织的接种试验证明,松材线虫携带的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burk-holderiacepacia)B619菌株的繁殖及对黑松的致病性受松材线虫的影响.进一步的研究表明,松材线虫的分泌物及死尸均可促进该菌株的生长繁殖和致病作用,且活线虫的促进作用比死尸更加显著,这可能是由于松材线虫提供给该菌株某些重要的营养物质.试验还发现,松材线虫分泌液经高温处理后对致病细菌繁殖的促进活性下降.

米酵菌酸:餐桌上的“隐形杀手”

凉皮和肠粉里面可能藏着一个“隐形杀手”--米酵菌酸,人中毒病死率超50%。这种菌酸到底是“何方神圣”?米酵菌酸的“厉害”:米酵菌酸为唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的有毒代谢产物。这种毒素环境适应性强且耐受干燥,因此可在外环境下长期存留。其致死率高,平均致死率为68%~89%,个别中毒事故病亡率甚至高达100%。中毒者初期均有恶心、呕吐、头晕、腹痛、嗜睡等症状。重症者可能还会出现脑、肝和肾脏病变。目前,尚无米酵菌酸特效解毒药物,病情及预后情况与摄入的毒素量有关。

利用recA基因序列分析鉴定云南酵米面中伯克霍尔德菌属分离株

目的利用recA基因序列分析对云南省两起酵米面食物中毒案例中伯克霍尔德菌属病原菌进行分类鉴定。方法对基于16S rRNA序列分析鉴定为伯克霍尔德菌属的4株分离菌株和1株唐菖蒲伯克霍尔德菌标准株(CICC 10574),通过聚合酶链式反应(PCR)扩增recA基因片段、测序,将测序结果与GenBank中伯克霍尔德菌属中73个种的对应片段序列比对,并构建系统发育树。结果比较分析伯克霍尔德菌属中73个种的recA基因的亲缘关系,recA基因可以准确地区分鉴定伯克霍尔德菌属中包括食物中毒案例中4个分离株的不同的种,特别是在区分唐菖蒲伯克霍尔德种内不同致病亚种时有参考价值。结论 recA基因序列分析将酵米面食物中毒分离株鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌,而且食物中毒案例中的4个分离株和植物病原菌及环境分离株的唐菖蒲伯克霍尔德菌的基因序列不同,具有独特的单核苷酸多态性(SNP),建议鉴定结果采用唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)。