唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种污染调查及其生长与产毒特性分析

唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病种(Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans,BGC)是迄今我国发现的发病率和死亡率最高的食源性致病菌。为调查广州市市售湿米面制品、银耳及木耳中BGC的污染状况,同时掌握在不同培养条件下BGC的生长与产毒规律,依据GB 4789.29-2020对100份食品样品进行定性分析;通过测定BGC菌株在各培养条件下菌液的OD600值和毒素含量,分析了不同的温度、时间、pH及NaCl浓度下BGC的生长状况与产毒能力。结果表明,100份食品样品中共检出1份(湿木耳)BGC阳性样品,污染率为1%(1/100);BGC的生长与产毒受培养基的影响较大,碱性(pH值为9.5~10.5)与一定渗透压(NaCl质量浓度为0.02~0.04 g/mL)环境下,BGC在马铃薯葡萄糖水中能生长,而在脑心浸液肉汤中几乎不生长,BGC在马铃薯半固体琼脂中的产毒量(231.24μg/mL)远大于BHI半固体琼脂和LB半固体琼脂;BGC适宜生长和产毒的温度为20~37℃、适宜pH值为4~8.5,其中最适生长温度与pH值分别为37℃、6.0,最佳产毒温度与pH值为30℃、7.0;BGC在低温(4~15℃)下仍能存活,且有少量的毒素产生(2.11μg/mL);当NaCl质量浓度为0.005 g/mL时,产毒量从未添加前的139.80降至52.27μg/mL,达到0.04 g/mL时,产毒为0。结果提示,广州市市售木耳中存在BGC污染的风险,在食品加工或贮存过程中添加一定浓度的NaCl可减少由BGC引起的食物中毒。

基于体温扩增的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种3种可视化快速检测方法的建立

为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM基因序列设计和筛选了ERA检测引物和探针,分别建立ERA显色法、荧光法、试纸条法3种可视化快速检测方法,并评估其特异性和灵敏度,以及在市售样品检测适用性和准确性。结果显示,建立的方法对3株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均有扩增,其他常见的食源性致病菌以及其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均无扩增,说明检测方法的特异性良好。3种方法的检出限均为10^(-2)ng/μL,灵敏度较好。采用建立的3种可视化快速检测方法对15份市售样品进行检测,检出阳性2份,检出率为13.3%。该结果与国标方法的检测结果一致,说明方法具有较好的适用性和准确性。本研究建立的基于体温扩增技术的显色法、荧光法和试纸条法具有较高的特异性及灵敏度,37℃体温扩增15 min左右即可获取检测结果,且裸眼可视,可为食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种的现场可视化快速筛查提供新型简便的策略。

唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种食物中毒分离株的遗传特性研究

目的对1株引起聚集性米酵菌酸中毒的生吊面浆食品样品分离株唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)DBJ进行全基因组测序并分析,解析菌株产毒及致病的基因特征。方法提取唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种DBJ基因组DNA,对菌株进行测序获得全基因组完成图,利用生物信息学分析手段对序列进行挖掘分析。结果菌株DBJ基因组由两个染色体(G1和G2)和一个质粒(P)组成,其中两个染色体大小均为4 Mb左右,质粒大小约为300 kb。两个染色体的GC含量也相仿,约为68.0%,质粒则稍低为63.0%。进一步分析发现,G2染色体上存在产米酵菌酸的bon基因簇。遗传进化分析后发现,菌株DBJ在亲缘关系上与加拿大玉米分离株UCD-UG_CHAPALOTE最为接近,两株菌处在同一进化分支。且255株菌种中有31株携带bon基因簇的菌株,较不携带该基因的唐菖蒲伯克霍尔德菌有明显遗传进化倾向。结论唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种DBJ分离株基因组中携带产米酵菌酸的bon基因簇,是引起食物中毒的主要原因。

云南省一例唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)食物中毒事件调查分析

目的调查分析云南省一例唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)食物中毒事件。方法参照GB/T4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》对样品进行唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检测。按照GB 5009.189-2016《食品安全国家标准食品中米酵菌酸的测定》检测样品中的米酵菌酸,采用液相色谱法对样品进行检测。用VITEK 2COMPACT全自动微生物生化鉴定仪和飞行时间质谱进行微生物鉴定。结果2份样品鉴定结果为唐菖蒲伯克霍尔德菌。2份样品均检测出米酵菌酸,含量分别为18.0和24.2 mg/kg。结论本次食物中毒源于食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)污染。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的研究进展

文章对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)命名历程、生物学特性、污染食品中毒作用机理、消毒和去毒及预防中毒措施等方面内容进行了综述,并展望了未来研究的方向。

唐菖蒲伯克霍尔德菌产毒差异菌株菌体脂肪酸分析

为了探讨脂肪酸与椰毒假单胞菌米酵菌酸毒素产生之间的相关性,采用气相色谱和面积归一法分别对产毒差异菌株的菌体脂肪酸进行分离和定量分析。结果显示,9株菌株共分离到11种组分,其中十六碳酸(C16:0)、顺-10-十七碳一烯酸(C17:1)以及顺,顺-9,12-十八碳二烯酸(C18:2n6c)含量较高,平均含量依次为43.85%、25.84%和14.75%。培养基及培养温度是影响脂肪酸组成的主要因素,相同培养条件下,9株菌株菌体脂肪酸组成相似度达90%以上。毒性试验后,不产毒菌株10574与产毒菌株菌体脂肪酸均发生相似变化,即顺-9-十八碳一烯酸(C18:1n9c)含量降低,而顺,顺-9,12-十八碳二烯酸(C18:2n6c)含量升高。生长条件是影响菌体脂肪酸组成的主要因素,脂肪酸与椰毒假单胞菌米酵菌酸产生的相关性不大。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种环介导等温扩增荧光方法的建立

【目的】建立一个基于环介导等温扩增与荧光探针结合的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)特异性检测方法。【方法】通过多重序列比对分析,选择B.gladioli pv.cocovenenans共有的bonA为靶位点,设计环介导等温扩增的特异性引物和荧光探针,通过19株B.gladioli和3株非目标菌株,验证该方法的特异性。将该方法的检测特异性与现有的基于实时荧光定量PCR鉴定B.gladioli pv.cocovenenans的方法进行比较,并对建立的方法进行灵敏度探究。【结果】建立的环介导等温扩增荧光鉴定方法对B.gladioli pv.cocovenenans具有特异性,能在30 min内得出结果,且该方法能进行可视化直接观测。该方法的基因组DNA最低检测限度为1.98 pg/μL,检测灵敏度为2.7×102 CFU/mL。另外,该方法能应用到食品样品中B.gladioli pv.cocovenenans的检测。【结论】本研究建立了一个快速、可视化、特异性强的检测方法,能有效用于B.gladioli pv.cocovenenans的快速筛查,为保障食品安全提供了一种快速、准确的分子检测手段。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型实时荧光PCR方法的建立

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)的实时荧光PCR方法。方法:根据唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14的米酵菌酸生物合成基因bonM序列,用Primer Premier 6设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立了实时荧光PCR反应体系。通过对5株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株及14株其他菌株进行实时荧光PCR检测,验证该方法的特异性。同时从菌液浓度和DNA浓度水平上进行研究,确定该检测方法的灵敏度。并同时采用该方法和GB 4789.29—2020,对155粉湿米粉及其原料大米进行检测,验证该方法的实用性。结果:实时荧光PCR方法特异性检测结果显示,5株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均扩增阳性,其他菌株均扩增阴性。通过灵敏度试验,确定该方法检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的菌液检测灵敏度为6.5×10^(2)cfu/mL,DNA检测灵敏度为4.8×10^(-4)ng/μL。实际样品的检测结果显示,采用该方法进行检测,2份湿米粉和3份大米PCR检测阳性,其余150份样品均为阴性,这与采用GB 4789.29—2020检测的结果一致,验证了该检测体系的实用性。结论:文章建立的实时荧光PCR检测方法,反应时间仅需1 h,设计的引物和探针具有较高的特异性及灵敏度,能够有效地用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的快速筛查,这为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的检测提供了一种简便、快速、准确的分子检测手段。

唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14毒力相关基因解析

目的了解1株引起致死性食物中毒事件的唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14的全基因组序列特征,对其基因组中米酵菌酸(BA)和毒黄素(TF)的生物合成相关基因进行了预测和分析。方法通过第三代高通量测序技术(PacBio)对Co14进行全基因组测序,使用BLAST软件预测BA和TF的生物合成相关基因。结果 Co14基因组中含有2个闭合的环状染色体,大小分别为4.1和4.0 Mb,鸟嘌呤和胞嘧啶所占比例(GC含量)分别为67.82%和68.32%。Co14基因组中还携带有一个146 kb的闭合环状质粒,GC含量为63.25%,编码149个基因。通过同源序列比对,在Co14染色体1上发现了BA和TF的生物合成相关基因簇bonR1R2LJKFGABDEHIM和toxRABCDE。结论 Co14全基因组数据为研究唐菖蒲伯克霍尔德菌食物中毒菌株的致病性和毒力因子产生机制奠定了遗传学基础。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌致病变种的危害及预防

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌致病变种是导致木耳、银耳、酵米面等食物中毒的病原菌,但目前媒体对该菌名称的使用较为混乱,对中毒防治和科普等工作造成了干扰。通过对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌致病变种的分类和名称演变进行梳理,并对其致病危害及主要预防措施进行了综述,以期为该致病菌引发的食物中毒预防工作提供理论指导。

唐菖蒲伯克霍尔德菌米酵菌酸生物合成机制

2018年中国暴发了多起由唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种引起的食物中毒事件,并有多例重症和死亡病例出现,给食品安全和人民健康造成了严重危害。该菌代谢产生的米酵菌酸是引起食物中毒和死亡的元凶。本文综述了唐菖蒲伯克霍尔德菌引起食物中毒的特征、米酵菌酸生物合成机制以及米酵菌酸产生的环境应答,展望了唐菖蒲伯克霍尔德菌米酵菌酸生物合成机制的研究前景。

一种固氮菌-唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的表型特征

目的对与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和椰毒伯克霍尔德氏菌有关的4株重要的菌株进行表型性状描述,以证明它们是同一个菌种。方法着重用传统的底物利用试验和GC及专用软件(Sherlock系统6.1)分析菌细胞的脂肪酸,做全面的表型描述。结果 4株菌的30项生化反应完全一致,170项底物利用试验95%一致,12种脂肪酸及脂肪酸组合基本一致;4株菌都是固氮菌。结论 4个株菌为同一个菌种,都可称为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。

利用recA基因序列分析鉴定云南酵米面中伯克霍尔德菌属分离株

目的利用recA基因序列分析对云南省两起酵米面食物中毒案例中伯克霍尔德菌属病原菌进行分类鉴定。方法对基于16S rRNA序列分析鉴定为伯克霍尔德菌属的4株分离菌株和1株唐菖蒲伯克霍尔德菌标准株(CICC 10574),通过聚合酶链式反应(PCR)扩增recA基因片段、测序,将测序结果与GenBank中伯克霍尔德菌属中73个种的对应片段序列比对,并构建系统发育树。结果比较分析伯克霍尔德菌属中73个种的recA基因的亲缘关系,recA基因可以准确地区分鉴定伯克霍尔德菌属中包括食物中毒案例中4个分离株的不同的种,特别是在区分唐菖蒲伯克霍尔德种内不同致病亚种时有参考价值。结论 recA基因序列分析将酵米面食物中毒分离株鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌,而且食物中毒案例中的4个分离株和植物病原菌及环境分离株的唐菖蒲伯克霍尔德菌的基因序列不同,具有独特的单核苷酸多态性(SNP),建议鉴定结果采用唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)。

米酵菌酸:餐桌上的“隐形杀手”

凉皮和肠粉里面可能藏着一个“隐形杀手”--米酵菌酸,人中毒病死率超50%。这种菌酸到底是“何方神圣”?米酵菌酸的“厉害”:米酵菌酸为唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的有毒代谢产物。这种毒素环境适应性强且耐受干燥,因此可在外环境下长期存留。其致死率高,平均致死率为68%~89%,个别中毒事故病亡率甚至高达100%。中毒者初期均有恶心、呕吐、头晕、腹痛、嗜睡等症状。重症者可能还会出现脑、肝和肾脏病变。目前,尚无米酵菌酸特效解毒药物,病情及预后情况与摄入的毒素量有关。

湿米粉和湿淀粉椰毒假单胞酵米面亚种的污染现状及检测

目的 调查2021年广州市番禺区湿米粉和湿淀粉制品中椰毒假单胞酵米面亚种的污染情况,探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)法和实时荧光定量PCR法的应用价值。方法 按照《食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检验》(GB/T 4789.29-2020)和《食品安全国家标准食品中米酵菌酸的测定》(GB 5009.189-2016)的要求进行检验。采用全自动微生物鉴定系统VITEK2 COMPACT生化法和MALDI-TOF MS法鉴定样品中的唐菖蒲伯克霍尔德菌,用实时荧光定量PCR法检测椰毒假单胞菌产毒bon基因和高效液相色谱法检测米酵菌酸。结果 40份样品中有2份湿米粉和1份湿淀粉制品检出唐菖蒲伯克霍尔德菌,1份湿米粉样品检出椰毒假单胞酵米面亚种。在唐菖蒲伯克霍尔德菌的鉴定中,MALDI-TOF MS法和实时法与传统生理生化检测法结果一致。结论 番禺区湿米粉和湿淀粉制品存在被椰毒假单胞酵米面亚种污染的风险。MALDI-TOF MS法和实时荧光定量PCR方法在鉴定该菌时更快速、结果更准确。

4例急性米酵菌酸中毒的诊治

对2021年发生的一起米酵菌酸中毒事件中4例患者的临床资料进行回顾性分析。4例患者的临床表现以呕吐、腹泻、肝损害为主,经早期血液灌流和血浆置换清除毒物以及护肝治疗,3例治愈、1例死亡。米酵菌酸中毒后病情进展快,易发生肝衰竭或多器官功能障碍而死亡。中毒的严重程度与患者体内米酵菌酸毒素的浓度有关,故早期对米酵菌酸毒素的测定对中毒诊治具有重要意义。对于确诊患者,早期积极行血液净化和护肝治疗对预后尤为重要。

一起米酵菌酸食物中毒致死事件的调查

目的 调查米酵菌酸食物中毒发生的原因,为预防和控制由此引发的食物中毒提供科学依据。方法 通过实验室快速检测确定致病因子,根据致病因子发病潜伏期推断可疑餐次及食物,结合流行病学调查、食品/环境卫生学调查、采样及检测结果,判定中毒餐次及食物。结果 流行病学调查提示食物与发病之间存在关联,病例发病潜伏期及临床表现符合米酵菌酸食物中毒发病特点,留样食物和病例血液检出米酵菌酸。结论 中毒餐次为2020年7月19日晚餐,中毒食物为炒河粉,原因是某食品厂在生产、运输等环节存在违规操作,使河粉受到细菌污染,细菌增殖并产毒,导致此次食物中毒。

乳清发酵粉对鲜湿河粉贮存过程中微生物的影响研究

本课题通过采用添加不同比例乳清发酵粉的方式,考察乳清发酵粉对鲜湿河粉贮存过程中微生物,特别是对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的影响。研究结果显示,在培养基体系中,0.1%乳清发酵粉可有效完全抑制4-lgCFU/mL唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长,呈现量效关系。仅添加0.1%乳清发酵粉即可有效遏制湿河粉体系中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长繁殖。以脱氢乙酸钠为对照,进一步探究乳清发酵粉对鲜湿河粉保鲜效果。结果表明,在相同添加量情况下,乳清发酵粉的保鲜综合效果更优,且当乳清发酵粉的添加量为0.1%和0.15%时,可分别将鲜湿河粉的贮存期延长至36 h和48 h。本课题为具有清洁标签的乳清发酵粉在鲜湿河粉保鲜中的应用提供了思路和参考依据。

“夺命”凉皮中的米酵菌酸,还会藏在哪些食物里?

最近,官方通报2女子吃凉皮1人死亡引发公众关注。河粉、肠粉等食物在高温潮湿的天气下易产生米酵菌酸毒素,中毒病死率超50%。米酵菌酸听起来有些陌生,但每年因它导致的中毒甚至死亡的悲剧却接连在上演。这个毒素病死率高。米酵菌酸是一种名叫唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的细菌代谢产生的外毒素。这种细菌的环境适应性强且耐受干燥,因此可在外环境下长期存留。

云南省文山州广南县吊浆粑食物中毒事件的病原学分析

目的分析云南省文山州广南县一起吊浆粑食物中毒事件,鉴定引起中毒的致病因素。方法在流行病学调查的基础上,对采集的4份食物样品参照GB/T 4789.29—2003进行微生物常规培养,对其中分离的疑似目标菌株进行VITEK 2 COMPACT生化鉴定和16S rRNA序列比对,并对样品进行动物中毒试验,采用液相色谱-质谱联用方法对样品中的米酵菌酸进行定量分析。结果分离的3株食源性致病菌的16S rRNA序列比对和VITEK 2COMPACT生化鉴定结果均为唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli),均可产毒使小鼠死亡,且样品中米酵菌酸含量超标,产毒量最高达9.67 mg/kg。结论该食物中毒事件是由唐菖蒲伯克霍尔德菌污染吊浆粑,产生大量米酵菌酸所致。从试验过程和结果分析,该菌株应为我国命名的椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomonas cocovenenans subsp.farinofermentans)。