我国稀有的热带观赏鱼——唐鱼Tanichthys albonubes Lin

本文记述唐鱼的形态特征、生态条件、养殖技术及其发现经过。

感染唐鱼的草鱼呼肠孤病毒分离与鉴定

广东省某渔场待出境送检唐鱼(Tanichthys albonubes)样品,经病理检查未发现临床症状,取样品的肝、脾和肾等器官组织,用细胞分离培养方法检测病毒性因子,发现该批次唐鱼样品的组织提取物能够造成EPC和CHSE-214细胞发生细胞病变效应(CPE),确定该样品携带病毒性病原。为探究唐鱼携带病原的种类,针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)S9核酸片段设计特异性引物,对产生CPE的细胞培养物进行RT-PCR核酸扩增和序列测定,用EPC细胞扩增该病毒,获得病毒含量为10^(6.25)TCID_(50)/mL的细胞培养物,通过高通量测序技术分析细胞培养物中的病毒类型,并用不同病毒含量的细胞培养物进行唐鱼感染性试验。测序结果经BLAST比对分析发现,扩增序列与GCRV 873株的S9核苷酸序列同源性达98%,鉴定病原为GCRV,将其命名为GCRV SZ0508株。全基因组测序序列注释为GCRV,通过vp2基因遗传进化分析发现,GCRV SZ0508属于I型GCRV。感染性试验中,感染组100%被感染,死亡率为3.3%,表明分离的GCRV能够感染唐鱼,具有造成唐鱼发生草鱼出血病的风险。

野生唐鱼在广东的再发现

唐鱼 (TanichthysalbonubesLin)又称白云金丝、白云山鱼 ,是我国特有的国家二级保护野生动物 ,在发现时个体数量已属稀少 ;近代仅分布于广州白云山及附近的山溪中 ;近 2 0年来 ,无野外发现该种的报道 ,被认为野生种群已经灭绝。作者在 2 0 0 3年 9月在广州的山溪中发现了该种的野生种群 ,并对该野生种群的形态、食性、生境、生长和繁殖做了初步研究 ,分析了致危因素 ,提出了保育措施。

唐鱼热休克蛋白60基因cDNA克隆及表达

采用RT-PCR和RACE技术,成功克隆了唐鱼(Tanichthys albonubes)热休克蛋白60基因cDNA全长序列,命名为TaHSP60(GenBank登录号:HM234132)。研究表明:该基因序列全长为2 486bp,5'端非翻译区(URT)102bp,3'URT 656bp,开放阅读框(ORF)1 728bp,编码575个氨基酸。序列比对分析表明唐鱼HSP60与斑马鱼(Danio rerio)的相似性高达96.2%,与鲫(Carassius auratus)、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大西洋鲑(Salmo salar)以及非洲爪蟾(Xenopus tropicalis)的相似性分别为93.2%、89.7%、88.3%和83.8%。Clustal X比对结果表明:该序列含有典型的mt-HSP60特征序列、ATP结合位点,以及C末端保守的重复区域GGM。进化分析结果表明,唐鱼HSP60与斑马鱼HSP60聚为一支,二者亲缘关系较近。荧光定量PCR显示唐鱼HSP60的mRNA在肝脏、肌肉、鳃、鳍条、眼睛、卵巢、肠道和脑等8种组织中均有表达,其中肝脏中表达量最高,而在鳃和鳍条呈微量表达。统计分析表明,其他各组织与肝脏相比均有显著差异。铜暴露后,唐鱼肝脏HSP70mRNA表达水平分别在48h和96h出现上调,均显著高于对照组。

唐鱼野生与养殖群体遗传多样性的随机扩增多态DNA(RAPD)分析

应用随机扩增DNA多态性(RAPD)技术对唐鱼野生与养殖群体的遗传多样性进行了分析。从40个10BP引物中选取15个用于群体遗传多样性分析,共检测出93个位点,其中46个(49.46%)呈多态;两群体的多态位点比例分别为43.01%和41.94%;用香农指数量化的遗传多样性指数,野生群体(0.23)略高于养殖群体(0.20),平均遗传多样性指数为0.22,群体内和群体间的遗传变异比例分别为85%和15%;群体的遗传相似度高达0.96,彼此间的遗传距离仅为0.04。研究表明,唐鱼目前的种质资源状况令人堪忧,恢复唐鱼有效种群大小、丰富物种遗传多样性是资源保护的基础。

铜、镉、锌对唐鱼的急性毒性及安全浓度评价

采用静水法生物测试研究铜(Cu+2)、镉(Cd+2)和锌(Zn+2)对唐鱼的急性毒性及安全浓度评价。其目的在于评价水环境中Cu+2、Cd+2和Zn+2对鱼类的影响,为渔业部门制订水质标准提供理论参考数据。结果表明:Cu+2对唐鱼为剧毒物质,Cd+2为高毒物质,Zn+2为中毒物质。3种重金属毒性依次为Cu>Cd>Zn。Cu+2、Cd+2和Zn+2对唐鱼的24、48、729、6 h的LC50分别为0.166、0.079、0.051、0.039 mg/L,9.051、6.404、4.9064、.447 mg/L,35.43、26.53、20.66、16.30 mg/L,其安全质量浓度分别为0.004、0.4451、.630 mg/L。唐鱼对Cu+2敏感,是一种较理想的环境污染指示生物。

唐鱼仔鱼耳石的形态发育及日轮

观察了实验室人工繁殖饲养的唐鱼(Tanichthys albonubes)仔鱼耳石形态发育,研究了其生长轮的沉积规律。唐鱼仔鱼耳石长径与鱼体全长(TL)均呈线性相关,其关系式为:微耳石Dl=0.019 6TL-0.031 0(r=0.961 6,P<0.001,n=218),矢耳石Ds=0.027 6TL-0.043 7(r=0.924 0,P<0.001,n=219),星耳石Da=0.016 6TL-0.004 1(r=0.369 6,P<0.001,n=44)。仔鱼耳石上第一个轮纹在孵出后第2 d形成,生长轮数目与仔鱼日龄(D)呈线性相关,其斜率与1无显著差异,因此生长轮为日轮,其关系式为:微耳石LI=1.006D-1.700 1(r=0.994 2,P<0.001,n=205),矢耳石SI=0.953 8D-0.911 6(r=0.993 5,P<0.001,n=161)。生长过程中矢耳石形状变化较大,星耳石出现时间较晚,而微耳石形状稳定,日轮可读性较好,故更适合作为日轮研究的材料。

典型重金属、多环芳烃及菊酯类农药对唐鱼的急性毒性效应

采用静水法生物毒性测试研究重金属(铜和镉)、多环芳烃(菲和萘)及有机农药(溴氰菊酯和氯氰菊酯)3类物质对唐鱼的急性毒性,详细描述中毒症状并进行了安全质量浓度评价。结果表明,铜和镉对唐鱼的96 h的LC50分别为0.054和4.610 mg/L,其中铜属于极高毒物质,镉属于高毒物质,其安全质量浓度分别为0.005和0.461 mg/L;菲和萘对唐鱼96 h的LC50分别为0.913和10.849 mg/L,菲属于极高毒物质,萘属于中毒物质,其安全质量浓度分别为0.091和1.085 mg/L;溴氰菊酯和氯氰菊酯对唐鱼96 h的LC50分别为1.217和6.256μg/L,均属于极高毒物质,安全质量浓度分别为0.122和0.626μg/L。唐鱼对这3类污染物质均有较高的敏感性,适合作为水体污染的监测生物。

唐鱼胚胎发育观察

唐鱼(Tanichthys albonubes)是一种小型鲤科鱼类,是华南地区的特有种。本研究报道对唐鱼胚胎发育过程的观察结果。唐鱼的受精卵近卵圆型,其卵径为(1.017±0.001)mm。根据其胚胎发育过程的形态特征,胚胎发育全程可划分为7个阶段:受精卵胚盘形成阶段、卵裂阶段、囊胚阶段、原肠胚阶段、神经胚形成阶段、器官形成阶段和孵化出膜阶段。观察结果表明,在不同的水温条件下发育历程不同:当水温分别在14.0-16.8℃、22.5-25.0℃和28-30℃条件下,受精卵分别经过147 h、50 h和28 h发育而孵出。文中讨论了唐鱼胚胎形态及胚细胞的分化特点,以及水温对胚胎发育的影响。

自然种群唐鱼的耳石、日龄与生长

为了解唐鱼自然种群的年龄结构和生长特征,根据耳石结构于2005年6月—2006年4月每2个月1次对栖息于从化市鹿子田附近自然水体唐鱼的日龄组成进行了调查。2005年6月采集到的唐鱼日龄集中在40～70d,8月和10月唐鱼种群既有较大个体,也有孵出不久的仔鱼,日龄分布在10～130d。2005年12月和2006年2月大部分唐鱼日龄在50d以上,2006年4月大部分唐鱼日龄则在50d以下。与人工养殖的唐鱼相比,自然种群唐鱼耳石生长轮的清晰度和对比度高,但生长轮宽度规则性较低。自然种群唐鱼的耳石长径与体长呈显著的线性关系,与体质量呈显著的幂函数关系。自然种群唐鱼的生长符合幂函数方程,体长(L,mm)、体质量(M,mg)与日龄(D,d)的回归关系分别为L=1.4685D0.5824(r=0.9081,P<0.001,n=266)和M=0.0048D2.0122(r=0.8844,P<0.001,n=266)。该生长方程反映了自然种群唐鱼早期的生长。8—10月唐鱼种群年龄结构最为复杂,根据其年龄结构的季节变化可以推测自然条件下唐鱼的繁殖期为3—12月。

17β-雌二醇对雄性唐鱼卵黄蛋白原的诱导及性腺发育的影响

以17β-雌二醇(E2)诱导雄性唐鱼产生卵黄蛋白原(Vtg),采用SephacrylS-300凝胶过滤层析柱提纯了雄鱼整体匀桨液的Vtg。结果显示,已确定被纯化的唐鱼Vtg在4%—7.5%Native—PAGE电泳中分子量为440kD左右,能同时被考马斯亮蓝、糖蛋白、磷蛋白、脂蛋白染色方法同时染色,是一种富含糖、磷、脂的蛋白。与对照组作比较,17β-雌二醇暴露组其体重明显下降(P<0.01),精巢发育滞后。结果表明,17β-雌二醇能够诱导雄性唐鱼产生大量的Vtg,并影响到其生长及精巢发育。雄性唐鱼Vtg可作为环境雌激素监测的有效生物学标记物。

转红色荧光蛋白基因唐鱼的遗传分析和生物学研究

转红色荧光蛋白基因唐鱼(Tanichthys albonubes)测交获得实验鱼,以表达红色荧光蛋白为表型性状,采用点杂交和遗传学分析相结合的方法,研究外源基因的遗传传递规律,并对转基因唐鱼和非转基因唐鱼的生长和繁殖等方面进行了比较。结果显示:测交后代表型的分离规律基本符合经典的孟德尔单显性基因遗传模式,外源基因属于单位点整合,测交后代中没有发现沉默整合个体;实验鱼的生长和可量性状对比实验表明,转基因唐鱼和非转基因唐鱼在仔鱼期到性成熟之间,生长速度无显著差异,性成熟个体的外部形态除体色外也无差别,繁殖力方面基本无显著差异。本研究结果表明了培育转红色荧光蛋白基因唐鱼纯系的可行性;同时在生长、繁殖方面的研究结果为评价转基因唐鱼的生态安全奠定了基础。

氯氰菊酯对唐鱼肝和鳃组织超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

在实验室条件下采用静水法生物测试,研究了氯氰菊酯对唐鱼(Tanichthys albonubes)的急性毒性及其对肝和鳃组织超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。结果表明,氯氰菊酯对唐鱼24、48、72、96h半致死浓度分别为27.27、15.94、10.13、6.61μg·L-1;经1、3、5μg·L-1浓度处理6、12、24、48、72h,结果显示唐鱼SOD在低浓度氯氰菊酯的胁迫下呈现明显的浓度效应关系,将唐鱼SOD作为农药等污染物的污染指标具有重要的应用前景,为安全使用农药和防止水体污染提供有益的理论参考依据。

唐鱼卵黄脂磷蛋白的纯化鉴定与免疫原性分析

采用Native-PAGE和SDS-PAGE方法从性成熟雌性唐鱼（Tanichthys albonubes）卵巢组织提纯了卵黄脂磷蛋白（Lv）．已确定被纯化的唐鱼Lv在Native-PAGE（4％～7．5％）电泳中分子量（Mr）为314×10^3．用纯化的唐鱼Lv免疫大白鼠获得鼠源多克隆抗血清．以Native-PAGE和SDS-PAGE制备的唐鱼Lv及裂解后的组分作为抗原所制备的抗血清，与经17β-雌二醇（E2）诱导的雄性唐鱼、去除卵巢的雌性唐鱼以及唐鱼卵巢的匀浆液能发生免疫反应，并且印迹位置与雌性特异蛋白卵黄蛋白原（Vtg）的位置相当．但是两种血清和未经E2诱导的雄鱼整体匀浆液并无反应，显示Lv及其大分子亚基的抗血清与Vtg和Lv两种蛋白足特异的．结果表明，唐鱼Lv裂解组分的抗血清可用于检测唐鱼的Vtg．

红色荧光蛋白基因在转基因唐鱼中的表达

在成功构建斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子转红色荧光蛋白基因唐鱼Tanichthys albonubes可遗传品系的基础上,作者采用荧光显微镜观察和用RT-PCR技术对外源基因在唐鱼体内的表达情况进行检测。结果表明:红色荧光蛋白基因在F3代唐鱼体内的表达最早出现在受精后19 d,多数个体的表达集中在25~30日龄,最晚的表达个体出现在35日龄;红色荧光蛋白的表达主要分布于肌肉、心脏、肝脏、脾、鳃、鳔、肠和性腺,在肌肉、肝脏、鳃组织中的相对表达量较其它组织高,而在表皮和鳍条中没有检测到外源基因的表达。虽然红色荧光蛋白在转基因唐鱼后代出现表达迟缓、表达特异性改变的现象,但在外源基因后代中的遗传和表达在总体上还是稳定的,有望培育出转红色荧光蛋白基因唐鱼品系。

唐鱼脑的组织形态学观察

应用光镜技术观察了唐鱼(Tanichthys albonubes)脑的形态学和组织学结构。结果表明,唐鱼脑基本结构与多数硬骨鱼类相一致,包括端脑、间脑、中脑、小脑及延脑五部分,端脑由嗅囊、嗅叶和大脑构成。脑的组织形态学特点为:嗅叶及嗅囊分化较明显,大脑呈长椭圆状,仍保留鲤科(Cyprinidae)鱼类脑的原始特征;间脑背面具一松果体,腹面中央有一心形漏斗,前端连接呈鸡心形的脑垂体;中脑视叶膨大,与视觉发达相关;小脑发达,与其活跃的生活习性相适应;延脑前部稍稍隆起。此外,对唐鱼脑保持硬骨鱼类较原始的结构特点及其生态学意义进行了探讨。

唐鱼的胚后发育

根据唐鱼（Tanichthys albonubes）发育过程特征，胚后发育可以分为孵出期、胸鳍形成期、鳔一室期、卵黄消失期、尾鳍分化期、背鳍分化期、鳔二室期、背鳍形成期、臀鳍形成期、腹鳍形成期、稚鱼期、幼鱼期和成鱼期。在水温23．0～29．0℃条件下，初孵仔鱼体全长为（2．760±0．002）mm。孵出后3天，巡游模式建立，仔鱼开口摄食；5天仔鱼卵黄耗尽，完全依赖外源营养；9天尾鳍开始分化，12天尾脊索上弯；15～18天，背鳍褶突起明显，鳍条原基出现；18天第二鳔室出现，肌节开始向“W”过渡；臀鳍与背鳍分化；33天，20％的仔鱼可观察到腹鳍条；45天，57．1％仔鱼身体长出鳞片；50～55天．体全长（15．62±1．65）mm，腹膜闭合，身体透明特点消失，进入幼鱼期。77天，部分性成熟较早的个体开始进行繁殖。同时文中讨论了唐鱼胚后发育特点及其保护生物学。

唐鱼β-actin基因近端和远端启动子的鉴定及其启动活性分析

利用高保真PCR技术获得唐鱼(Tanichthys albonubes)长为1.3 kb的β-肌动蛋白(β-actin)近端启动调控序列(TA,1.3 kb)。在此基础上采用基因组步移技术(Genome walker)获得5′侧翼上游序列1.7 kb,再根据所获的近端启动子序列和上游序列设计引物,扩增获得全长为3.0 kb的唐鱼β-actin基因远端启动调控序列(TLA,3.0 kb)。此1.3 kb和3.0 kb启动调控序列均包含3个转录活性元件:CAAT Box(-89^-85),CArG Box(-59^-49),TATA Box(-26^-20)。利用启动子分析软件TRANSFAC 6.0分析,结果显示启动调控序列(-105~1261)中含有E-Box、NF-Y、Sp1等多个重要转录因子结合位点,在远端启动调控序列(-1719~1261)中还含有更多的重要转录因子结合位点。将这两个序列分别定向克隆到红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达载体中,构建重组表达载体pTLA-DsRed和pTA-DsRed,并分别注射到唐鱼受精卵中,结果显示转pTLA-DsRed基因唐鱼的阳性率较转pTA-DsRed的高,且所发出的红色荧光的强度也比后者的强。采用RT-PCR检测孵化后第15天的转基因唐鱼中RFP的mRNA,结果显示转pTLA-DsRed基因唐鱼中RFP mRNA的表达量比转pTA-DsRed基因唐鱼高35.7%。结果表明两种长度的启动调控序列均能有效驱使外源基因在唐鱼体内表达,且长度为3.0 kb的启动子序列具有更强的驱动活性。

唐鱼仔鱼对饥饿的应对策略研究

研究了延迟投喂对唐鱼（Tanichthys albonubes）仔鱼存活和生长的影响,探讨唐鱼仔鱼对饥饿的应对策略. 结果显示,在水温26.0±1.0℃条件下,唐鱼仔鱼在孵出后的2.5～3 d开口摄食,5 d卵黄消耗完毕. 18～25 d,延迟投喂0～3 d仔鱼的存活率在80.4%～93.3%间变动,各组间的差异不显著（p＞0.05）;延迟投喂4 d,仔鱼的存活率下降至50%;延迟投喂5 d,仔鱼的存活率极显著下降,只有30.0%左右. 延迟投喂6 d以上,仔鱼的存活率为0,表明在本实验条件下唐鱼仔鱼的不可逆点（PNR）为孵出后的9 d. 延迟投喂2 d开始,仔鱼的生长便受到不同程度的影响,延迟投喂3 d是仔鱼的生长低谷,延迟4～5 d,仔鱼反而得到不同程度的恢复. 25 d内,延迟投喂5 d仔鱼恢复到与正常投喂组接近的生长水平. 由此提出关于仔鱼应对饥饿对策的＂存活与生长交易临界点＂和＂生存机遇期＂两个观点,并对它们的生态学意义作了初步地探讨.

唐鱼自然群体栖息地水环境调查

于2005年6月至12月,每两个月一次调查从化市鹿田镇唐鱼自然群体栖息地的水环境,分析了水质、底泥以及浮游生物数量和组成特点。结果表明,栖息地水体6月,12月水质较好,8月总氮含量偏高,10月总氮、总磷含量都高,而COD值一直都较高。底泥的凯氏氮和有机质含量高,而磷含量相对较低。8月浮游植物密度达到最大值,其群落组成特点是,硅藻种数多,蓝藻、绿藻种数少,而数量上,硅藻少,蓝藻多,绿藻次之。8月浮游动物密度大,种数多,其他月份数量和种数相对较少。