变形链球菌牙面粘附唾液受体的筛选和纯化

目的:筛选和纯化变形链球菌血清型c(简称变链)的牙面粘附唾液受体。方法:用全唾液包被羟基磷灰石形成实验性获得性膜(SAP),后用1mol/LNaCl和0.5mol/L磷酸盐缓冲液分步洗脱,再用SephadexG75分子筛层析和DEAE-SephadexA25离子交换层析对SAP组分进行分离纯化,用细菌粘附实验和细菌粘附竞争抑制实验筛选受体,经聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、淀粉酶活性测定等实验鉴定。结果:IgA降解片段、淀粉酶和分子量为13kD的蛋白是变链的牙面粘附唾液受体,其中IgA降解片段和分子量为13kD的蛋白为隐匿受体,淀粉酶组份在变链粘附中具双重作用。

变形链球菌表面粘结素与唾液受体结合特异性的初步研究

目的研究变形链球菌表面粘结素与唾液受体间的对应结合关系。方法采用３Ｈ标记的变形链球菌（简称变链）竞争性粘附抑制实验及自行设计的间接酶联免疫受体结合实验，检测纯化唾液受体与纯化变链表面粘结素间的结合特异性及其强度。结果唾液ＩｇＡ降解片段和相对分子质量为１３０００的酸性蛋白仅促进变链粘附，唾液淀粉酶具有促进粘附及抗粘附双重作用。相对分子质量为１２７０００的变链表面粘结素及ＧＴＦ组分分别可竞争抑制变链对ＩｇＡ降解片段及淀粉酶的粘附，蛋白质Ｐ１和相对分子质量为１１７０００的粘结素可同时竞争抑制变链对此二种唾液组分的粘附；间接酶联免疫受体结合实验表明各变链粘结素不与ＩｇＡ降解片段有效结合。

去唾液酸糖蛋白受体介导甘草次酸壳聚糖微球的质量评价

目的:甘草次酸具有多种药理作用,如抗肿瘤、抗炎和抗病毒等。对甘草次酸进行修饰,制成靶向缓释制剂可以使药物准确到达作用部位,降低对其他组织的伤害。实验制备去唾液酸糖蛋白受体介导的甘草次酸壳聚糖微球,并对所制备的微球进行表征和质量评价。方法:采用乳化交联法制备,并对壳聚糖微球的粒径、Zeta电位、红外光谱图、包封率和载药量、体外释放度及稳定性等方面进行考察。结果:制备的微球粒径为1.106~1.718μm,Zeta电位为(15.13±1.76)mV,包封率为82.4%,载药量为1.02%,24 h体外释放度为77.09%,稳定性有待提高。结论:去唾液酸糖蛋白受体介导的甘草次酸壳聚糖微球,可为研制靶向肝药物提供一定的理论依据和实践基础。

鹧鸪禽流感病毒和人流感病毒唾液酸受体分布特征

目的探讨鹧鸪禽流感病毒和人流感病毒唾液酸受体分布特点及其作用。方法用亲和组化法检测鹧鸪呼吸道与消化道流感病毒唾液酸受体的分布,荧光素Alexa488标记禽流感病毒H9N1和人流感病毒H1N1,分别与鹧鸪呼吸道、消化道各解剖部位组织细胞结合。结果鹧鸪呼吸道同时表达SAα-2,3Gal和SAα-2,6Gal两种受体,但其消化道仅表达SAα-2,3Gal受体。SAα-2,3Gal受体在鹧鸪呼吸道各部位和消化道结肠上皮细胞呈强阳性弥漫分布;SAα-2,6Gal受体在呼吸道气管、支气管和次级支气管呈强阳性弥漫分布,而副支气管、消化道结肠均为缺乏或仅表达极少量。H9N1禽流感病毒与鹧鸪呼吸道各部位和消化道结肠均结合;人流感病毒H1N1与鹧鸪的气管、支气管、次级支气管结合,但未见与副支气管和结肠结合,此结果与鹧鸪呼吸道和消化道SAα-2,3Gal和SAα-2,6Gal受体分布总体一致。结论鹧鸪同时表达SAα-2,3Gal和SAα-2,6Gal受体,能与禽流感病毒和人流感病毒结合,有助于禽流感病毒与人流感病毒基因重配,提示其可充当流感病毒潜在的中间宿主。

去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的优化表达及亲和常数的测定

目的:表达及纯化抗去唾液酸糖蛋白受体(ASG-PR)的单链抗体的可溶性,并测定其亲和常数。方法:用噬菌体C1克隆感染E.coliHB2151,挑取单个菌落接种于2×TY培养基中,于37℃震荡培养过夜。将培养物作1∶100稀释并转种后,用终浓度为0.25、0.5、1.0mmol/L的IPTG,分别在37℃、25℃和20℃下诱导表达过夜。取其培养上清,用饱和硫酸铵沉淀后,以120g/LSDS-PAGE分析。另外,将饱和硫酸铵沉淀物用30mLPBS重新溶解、透析除盐后,用Ni2+螯合柱进行纯化,再以120g/LSDS-PAGE鉴定纯化scFvC1的纯度。用非竞争酶免疫法测定scFv的亲和常数。结果:用0.5mmol/LIPTG在25℃诱导过夜,表达的scFvC1的量较多,其相对分子质量(Mr)约为28000,以可溶性的形式存在于培养基中。通过Ni2+亲和柱纯化后scFvC1的纯度在95%以上,产量约为0.8mg/L。scFv的亲和常数为(2.31±0.36)×10-7mol/L。结论:以筛选的C1噬菌体感染E.coliHB2151后可表达低亲和力的可溶性scFv,对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。

SPF鸡各组织中流感病毒唾液酸受体的分布

为了解SPF鸡体内各组织中流感病毒唾液酸受体分布状况,本研究采用凝集素免疫荧光组织染色的方法,系统检测了流感病毒唾液酸受体在SPF鸡呼吸系统、消化系统以及其它系统各组织中的分布,并进行半定量分析。结果表明,大部分组织中均同时存在唾液酸α2,3-半乳糖受体与唾液酸α2,6-半乳糖受体,只有少部分组织仅存在其中一种受体,这种受体分布的广泛性与流感病毒组织噬性相一致;但鼻甲与喉头中唾液酸受体明显低于许多其他组织,这也表明不能简单的通过唾液酸受体的有无或者密度高低来判定病毒在各组织中的实际分布与复制增殖情况,或许还有其他机制参与了病毒入侵与增殖的过程。

肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的流式细胞分析

建立肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体 (ASGPR)的流式细胞分析方法 (FCM ) ,对正常及损伤鼠肝细胞、肝癌细胞 (BEL 740 2 )表面的ASGPR作同步比较分析 .以异硫氰酸荧光素标记的新半乳糖白蛋白 (FITC NGA)为ASGPR的特异性配体 ,以培养的正常肝细胞 (L 0 2 )为靶细胞 ,建立肝细胞表面ASGPR的FCM .测定并计算正常及损伤鼠肝细胞 ,BEL 740 2细胞与同一浓度的FITC NGA同步反应后的平均荧光强度 (MIF)值 .FITC NGA与L 0 2细胞表面ASGPR趋近饱和结合的浓度为 0 4mg/L ,该浓度下正常及损伤鼠肝细胞 ,BEL 740 2细胞的MIF值分别为 2 2 8 7、 5 81、 1 13.该结合可以被至少 5 0倍于FITC NGA的NGA或10mmol/L的EDTA完全抑制 .FCM能够良好地揭示FITC NGA同ASGPR之间的受配体结合特性 .该方法证实BEL 740 2细胞表面几乎没有ASGPR ,损伤鼠肝细胞表面ASGPR的数量较正常鼠肝细胞显著减少 .

去唾液酸糖蛋白受体介导的肝脏靶向性研究进展

去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)又称半乳糖受体,主要表达于哺乳动物肝窦状隙的肝实质细胞表面,参与多种生理功能。多年来ASGPR一直被用于介导药物和基因的肝靶向递送以及肝脏成像等方面的研究,目前已取得许多进展。ASGPR介导的药物肝靶向递送研究主要集中在抗肿瘤药物、降胆固醇药物等。基因肝靶向递送多见于反义药物。肝脏成像研究包括评价肝脏功能、鉴别肝细胞肝癌和肿瘤肝转移灶等。近年来ASGPR的靶向性应用研究还进一步扩展到肝细胞立体培养、肝细胞筛选及肝细胞移植等领域。本文就这些内容作一综述。

肝去唾液酸糖蛋白受体显像:三维分段肝功能评估的前景

去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是哺乳动物肝细胞表面的特异性受体,肝硬化和肝癌时ASGPR水平下降。利用99mTcGSA进行该受体的显像,能够得到HH15、LHL15、[R]0、R0等指标用于肝功能的评估;将这种功能性显像与单光子发射型计算机断层显像(SPECT)技术相结合,可以模拟肝脏切除的范围,并预测术后剩余肝脏的功能。此技术在国际上是一个新的课题,在国内尚无开展,用它来数字化的评估手术风险对患者手术方式的选择及预后具有重要影响。笔者结合正在进行的这方面部分研究,向读者作一介绍,以期在临床上发挥更好的作用。

乙型肝炎病毒X蛋白与去唾液酸糖蛋白受体2突变体相互作用的研究

目的:筛选并克隆鉴定人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,明确HBxAg在HBV感染及致癌过程中的具体作用。方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出阳性目的片段并测序,进行生物信息学分析。根据Genbank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录出去唾液酸蛋白受体2(ASGPR2)突变体的完整序列,克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀再次证明HBxAg与ASGPR2突变体的结合作用。结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能分解X-α-半乳糖(X-α-gal)变成蓝色的真阳性菌落41个,其中有一个是ASGPR2的新突变体。HepG2细胞的mRNA中能逆转录出ASGPR2的全基因序列, 体外免疫共沉淀结果证实该突变体与HBxAg在体外也有结合作用。结论:成功克隆出HBxAg的肝细胞结合蛋白,发现一新的ASGPR2突变体,并证实HBxAg与ASGPR2突变体在体外及酵母细胞内均有结合作用。

中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体糖基结合域的原核表达与多克隆抗体的制备

目的:构建中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1和H2亚基糖基识别域(CRD)的原核表达质粒,体外表达纯化后制备多克隆抗体。方法:RT-PCR扩增出中国旱獭肝组织中ASGPR CRDH1和CRDH2 cDNA,将其克隆至原核表达载体pRSET-B中,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内诱导表达。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附试验、Western blot及免疫组织化学检测抗体的灵敏度和特异性。结果:成功构建了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域原核表达质粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2,目的蛋白可以高效表达,用其免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论:首次成功表达了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域多肽,且纯度高,免疫原性强,用其免疫小鼠获得的多克隆抗体特异性好、效价高,为在HBV感染模型-中国旱獭体内进行肝脏疾病的靶向治疗奠定了实验基础。

基于去唾液酸糖蛋白受体的循环肝癌细胞磁性分选检测法及其改良

目的:介绍一种肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)富集和检测系统,并对该系统进行改良,以提高循环肿瘤细胞的检出率.方法:去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)是一种特异表达于肝实质细胞膜的跨膜蛋白.我们建立了一种基于ASGPR的磁性分选和Heppar1免疫鉴定的循环肝癌细胞富集和计数系统.首先以生物素化去唾液酸胎球蛋白作为配体与肝癌细胞结合,然后用抗生物素抗体磁珠进行间接磁性标记,从而磁性捕获循环肝癌细胞,接着用Heppar1进行免疫荧光染色鉴定,并对阳性细胞进行计数.文献报道和实际操作中发现,检测过程中采用肝素抗凝会引起细胞悬液中出现凝胶,影响细胞通过分离柱,降低分离效率.我们将部分步骤改用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)替代肝素抗凝,采用Hep3B肝癌细胞掺入试验对两种方法回收情况进行比较.结果:部分步骤改用EDTA抗凝后,细胞悬液中未出现凝胶现象.细胞掺入试验显示,5mL健康志愿者外周血中分别掺入10、30、90、270和810个Hep3B细胞,在每个掺入水平,改良法Hep3B细胞的平均回收率均≥70%,回收效率明显增加(P<0.05).结论:基于ASGPR的循环肝癌细胞富集和计数系统是一种具有临床应用潜能的循环肝癌细胞检测方法.经改良后能够有效消除细胞悬液中凝胶形成的现象,肝癌细胞回收效率较原检测法明显提高.

应用去唾液酸糖蛋白受体及临床指标建立肝储备功能定量评估系统

目的探讨应用肝细胞表面ASGPR流式细胞分析及临床指标建立肝储备功能定量评估系统,并与Child-Pugh评分进行比较,了解其在患者术前肝储备功能评估中的临床应用价值。方法选择32例肝占位病变行肝部分切除术患者,术前检测ICGR15与EHBF、R值与K值以及临床生化指标、Child-Pugh评分,以此作为自变量(Xn),以肝组织标本PHCASGPR+为因变量(Y),通过多元线性回归分析,建立肝储备功能定量评估系统,并与Child-Pugh评分进行比较,了解两种方法预测术后肝功能代偿情况的准确率。按照回归方程计算46例肝占位病变接受肝部分切除术及肝硬化并门脉高压症接受断流术患者肝储备功能定量值,评估肝储备功能情况,预测术后肝功能恢复情况,比较术前不同Child-Pugh分级与Y值患者术后肝功能恢复情况。结果在预测术后肝功能代偿良好准确率方面,Y值优于ChildPugh分级(P=0.030);而在预测术后肝功能代偿不良准确率方面,Y值与Child-Pugh分级无统计学差异(P=1.000)。结论新肝储备功能定量评估系统能一定程度提高肝切除或肝硬化患者术前肝储备功能评价准确度,具有临床应用价值。

抗去唾液酸糖蛋白受体抗体在慢性肝炎的分布差别研究

目的检测慢性乙型肝炎(简称慢性乙肝)、慢性丙型肝炎(简称慢性丙肝)患者和健康人群血清中抗去唾液酸糖蛋白受体抗体(anti-ASGPR)水平,观察anti-ASGPR与肝炎患者疾病发展的关系。方法选取HBV感染患者60例(慢性乙肝患者30例,慢性乙肝后肝硬化患者30例)、HCV感染患者60例(慢性丙肝患者30例,慢性丙肝后肝硬化患者30例),60例健康体检者为对照组,检测所有研究对象血清中anti-ASGPR、ALT的水平。结果 (1)HBV、HCV感染组血清anti-ASGPR水平均比对照组明显增高,差异均有统计学意义(P<0.01)。慢性乙肝后肝硬化组血清anti-ASGPR水平明显比慢性乙肝组高,差异有统计学意义(P<0.05)。慢性丙肝后肝硬化组血清anti-ASGPR水平明显比慢性丙肝组高,差异有统计学意义(P<0.05)。anti-ASGPR与ALT值无相关性。(2)丙肝组anti-ASGPR血清学水平明显高于乙肝组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论检测anti-ASGPR有助于临床的鉴别诊断,对治疗和预后具有重要的意义。

去唾液酸糖蛋白受体的研究现状

去唾液酸糖蛋白受体（ asialoglycoprotein receptor ， ASGPR），也被称为肝细胞半乳糖/N-乙酰基葡糖胺受体，或者 Ashwell-Morell 受体[1]。它主要表达于肝窦状间隙的肝实质细胞表面，是第一个被发现的凝集素。由于它结合配体的钙离子依赖性，因此属于 C 型凝集素。ASGPR 能够介导去唾液酸化的糖蛋白被肝细胞内吞降解[2]。目前已知的ASGPR 的配体非常多，提示其在糖蛋白代谢、脂代谢、凋亡细胞降解、调节凝血、介导病毒进入细胞和自身免疫性炎症反应等多个生理环节均发挥着重要的作用[3]。

去唾液酸糖蛋白受体抗体阳性的Ⅰ型自身免疫性肝炎生物学性状及其意义

目的:探讨去唾液酸糖蛋白受体抗体(Auto-antibodies to asialoglycoprotein receptor,anti-A S G P R)阳性和阴性Ⅰ型自身免疫性肝炎(type Iauto-immune hepatitis AIH-Ⅰ)在临床、生化、免疫学、遗传学、组织学特点及其治疗应答反应的差异.方法:应用酶联免疫分析法(ELISA)检测79例确诊的AIH-Ⅰ患者血清中anti-ASGPR,将其分为anti-ASGPR阳性组及阴性组.结果:患者中anti-ASGPR阳性的百分比为75%,阳性患者(n=59)中,男性(n=7),女性(n=52),平均年龄(49.1±8.6)岁;阴性患者(n=20)中,男性(n=2),女性(n=18),平均年龄(47.1±7.9)岁,阳性患者与阴性患者在年龄、性别、ALT、AST、ALP、GGT、ANA、S M A、D R3、D R4比较差异无统计学意义,而在IgG、补体C3水平,组织学炎症活动及纤维化程度、治疗应答方面有统计学意义(P<0.05).结论:anti-ASGPR与AIH-Ⅰ患者炎症活动及病理改变存在一致性,且其对治疗应答有一定的提示.

12株H9N2亚型禽流感病毒与Sia-α-2,6-唾液酸受体结合力的变化研究

为分析H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)对Sia-α-2,6-唾液酸受体(Sia-α-2,6-Gal)结合力的变化趋势,选择2001~2013年分离自山东省的12株H9N2 AIV进行研究。利用同源建模、分子动力学和分子对接等计算方法,对12株H9N2 AIV的HA蛋白与Sia-α-2,6-Gal之间相互作用进行系统研究,筛选HA蛋白中与Sia-α-2,6-Gal结合的关键氨基酸,并对关键氨基酸进行饱和突变研究。结果显示:随着分离年代临近,H9N2 AIV对Sia-α-2,6-Gal亲和能力有增强趋势,Thr198、Leu234、Met235位点的某种氨基酸突变能够大幅提高HA蛋白与Sia-α-2,6-Gal的结合能力。推测H9N2 AIV对哺乳动物感染能力呈逐渐增强趋。

去唾液酸糖蛋白受体H1亚基的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1亚基,制备兔抗人ASGPR1多克隆抗体。方法以质粒pEA1为模板,设计引物,将聚合酶链反应(PCR)扩增产物H1基因克隆到原核表达载体pET-32c中。接种含H1/pET-32c的菌株BL21单菌落至LB肉汤中,1∶100稀释转种后用1 mmol/L终浓度的异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,用纯化的ASGPR1免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果H1/pET-32c在原核系统中成功表达和纯化出约50.3 kD大小的融合蛋白,用纯化的H1成功制备了兔抗人H1多克隆抗体,并用6His-H1和GST-H1重组蛋白进行免疫印迹技术(Western blot)分析,证实了抗体的正确性。结论应用多克隆抗体可以检测体内外ASGPR H1亚基基因的表达,为临床上测定血清可溶性ASGPR奠定基础。