唾液富组蛋白5克隆载体的构建

目的将唾液富组蛋白5(histatin5)的cDNA克隆至T载体,获取大量酶切后的目的片段。方法选用大肠杆菌偏爱密码子编码histatin 5氨基酸,设计5′端带酶切位点、3′端互补的两条引物,通过overlap PCR获取histatin 5的cDNA,将cDNA与T载体连接后转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,PCR、酶切、测序鉴定。酶切重组T载体,获取目的片段。结果Histatin 5的cDNA正确克隆至T载体,无突变。结论克隆载体构建成功,有利于目的片段的酶切和回收。

唾液富组蛋白5的原核表达、纯化与抗菌活性鉴定

设计一对3′端互补、5′端带酶切位点的引物,用PCR扩增唾液富组蛋白5(H5)基因(h5),将载体pGEX4T-2和h5双酶切、连接、转化DH5α,将筛选鉴定的重组质粒pGEX4T-2-h5转化BL21(DE3)。诱导重组菌BL21(DE3)-pGEX4T-2-h5表达,纯化融合蛋白GST-H5,用Thrombin切去GST标签获取重组H5(rH5),测试rH5抗白色念珠菌(Candida albicans)活性。试验成功构建了重组载体pGEX4T-2-h5,在37℃重组菌BL21(DE3)-pGEX4T-2-h5生长至OD600 nm=0.6时用1 mmol/L IPTG于20℃诱导9 h,可获得高水平表达的融合蛋白GST-H5;酶切后获得的rH5对白色念珠菌生长有较强的抑制作用,rH 5产率约2 mg/L。

唾液富组蛋白5表达载体的构建

目的将唾液富组蛋白5 cDNA克隆至表达载体pGEX-4T-1。方法EcoRⅠ+SalⅠ双酶切克隆载体pMD19-T-hrp5及pGEX-4T-1,回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX-4T-1,将二者连接后转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选阳性菌落,PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX-4T-1,无突变。结论重组载体pGEX-4T-1-hrp5构建成功。

唾液富组蛋白5应用于口腔疾病的研究进展

富组蛋白是存在于人类唾液中的一种抗菌肽,可作为宿主非免疫防御系统的重要组成部分。富组蛋白5作为最有效的抗菌肽之一,与口腔念珠菌病、牙周病、龋病等多种口腔疾病相关联,其具有参与抗真菌、抑制细菌生长与定植、抑制宿主蛋白酶和细菌蛋白酶等生物学活性,但作用机制尚不十分明确。因此,对唾液富组蛋白5的研究具有重要意义。文章就唾液富组蛋白5应用于口腔疾病的研究进展做一综述。

唾液HRP5第17位密码子反义突变对其在毕赤酵母中表达的影响

目的在毕赤酵母中表达唾液富组蛋白5(HRP5)基因原始序列hrp5及突变序列hrp5′(Lys17→Asn),比较表达量及抗白色念珠菌活性。方法选用毕赤酵母偏爱密码子,设计3′端互补、5′端带酶切位点的两对引物,PCR合成hrp5和hrp5′,克隆至pPICZα-A,转化大肠杆菌,将酶切、测序鉴定的阳性重组质粒pPICZα-A-hrp5和pPICZα-A-hrp5′经SacI线性化后电击转化GS115,筛选阳性菌落,PCR鉴定,甲醇诱导表达,比较抗菌活性,测定表达量。结果hrp5及hrp5′正确整合到GS115基因组中,突变前后表达产物与HRP5标准品活性相当,表达量分别为4μmol/L、5μmol/L。结论HRP5在毕赤酵母中成功表达,活性区Lys17突变为Asn使表达量提高25%,而对其杀菌活性无影响。

唾液Histatin5突变体在巴斯德毕赤酵母中的优化表达

目的通过优化重组毕赤酵母GS115-pPICZα-A-HRP5′表达条件,提高表达水平,增强产物抗菌活性。方法将培养基甘油含量、pH、诱导前培养时间、甲醇诱导量、诱导后培养时间设置不同梯度,采用琼脂孔穴扩散法比较各梯度下表达产物抗菌活性。结果以pH6.0、甘油含量2.0%YEPG培养基、培养30h后用1.5%甲醇诱导培养48h,表达产物抗菌活性最高。结论优化条件为HRP5′的大规模发酵奠定了基础。