中年人唾液糖蛋白水平与患龋风险的相关性研究

目的：检测35～44岁中年人唾液糖蛋白水平，探讨其与中年人患龋状况之间的相关性，为寻找龋病的生物标志物提供资料。方法：随机抽取常州市口腔医院就诊的200例中年患者进行口腔检查，根据检查结果随机分成两组：①无龋组(DMFT=0)，②有龋组（DMFT＞0），抽取无龋组20例，有龋组30例，分别检测两组唾液糖蛋白水平，检查有龋组患龋情况并记录龋失补牙数（DMFT），龋失补牙面数（DMFS），龋蚀指数（CSI）。应用SPSS17.0软件包对试验数据进行统计分析。结果：无龋组唾液糖蛋白水平显著低于有龋组（P＜0.05）；有龋组唾液糖蛋白水平与龋失补牙数（DMFT），龋失补牙面数（DMFS），龋蚀指数（CSI）显著正相关。结论：唾液糖蛋白水平与中年人患龋指数具有相关性。

去唾液酸糖蛋白受体介导甘草次酸壳聚糖微球的质量评价

目的:甘草次酸具有多种药理作用,如抗肿瘤、抗炎和抗病毒等。对甘草次酸进行修饰,制成靶向缓释制剂可以使药物准确到达作用部位,降低对其他组织的伤害。实验制备去唾液酸糖蛋白受体介导的甘草次酸壳聚糖微球,并对所制备的微球进行表征和质量评价。方法:采用乳化交联法制备,并对壳聚糖微球的粒径、Zeta电位、红外光谱图、包封率和载药量、体外释放度及稳定性等方面进行考察。结果:制备的微球粒径为1.106~1.718μm,Zeta电位为(15.13±1.76)mV,包封率为82.4%,载药量为1.02%,24 h体外释放度为77.09%,稳定性有待提高。结论:去唾液酸糖蛋白受体介导的甘草次酸壳聚糖微球,可为研制靶向肝药物提供一定的理论依据和实践基础。

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白化学结构分析及对前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

目的:成熟的鲫鱼卵经提取、分离纯化得到唾液酸糖蛋白(sialyglycoproteins of Carassius auratus eggs,CA-SGP),分析其化学结构,及对前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响。方法:采用水提法从成熟鲫鱼卵中提取水溶性蛋白,经阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱分离纯化鲫鱼卵水溶性蛋白得到CA-SGP,测定其基本组成,采用高效凝胶液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子质量和纯度,PMP柱前衍生高效液相色谱法测定其单糖组成;采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞的增殖率,酶联免疫法测定Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,COLⅠ)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的分泌量及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性,茜素红染色法测定矿化结节的数量。结果:得到单一的组分CA-SGP,在高效凝胶过滤色谱色谱图上呈现单一的糖和蛋白的检测重叠峰,在凝胶电泳图上呈现单一弥散性条带,其蛋白质含量为14.33%,己糖含量为62.81%,N-乙酰神经氨酸(N-acetylneurainic acid,Neu5Ac)含量为19.72%。单糖组成测定结果显示:CA-SGP主要由甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖胺组成,其物质的量比为7.61∶6.70∶1.00;MC3T3-E1细胞与CA-SGP共同孵育后,其增殖率显著增加,COLⅠ和OCN的分泌量分别增加了39.28%和83.06%,ALP活性提高了285.08%,矿化结节的数量增加了96.41%,说明CA-SGP显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化。结论:CA-SGP为富含Neu5Ac的糖蛋白,具有显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的作用,对开发抗骨质疏松功能性食品具有重要意义。

肝癌细胞膜上转铁蛋白受体和去唾液酸糖蛋白受体数量的变化

目的:研究肝癌细胞膜摄取转铁蛋白受体的变化。方法：采用免疫组化及配体受体结合法分别测定正常肝脏、肝癌组织及癌旁肝组织转铁蛋白受体及去唾液酸糖蛋白受体的含量。结果：肝癌组织中转铁蛋白受体的含量高于癌旁及正常肝组织，而去唾液酸糖蛋白受体却明显低于癌旁及正常肝组织。结论：该变化有利于肝癌细胞对转铁蛋白的有效提取，也增加了肝癌细胞对高度唾液酸化的转铁蛋白的相对特异性摄取。

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对去卵巢大鼠骨质疏松症的改善作用

目的:从鲫鱼卵中提取唾液酸糖蛋白,研究其对去卵巢大鼠骨质疏松症的改善作用,并探究其作用机理。方法:采用切除大鼠双侧卵巢的方法建立骨质疏松症大鼠模型,灌胃鲫鱼卵唾液酸糖蛋白(400 mg/(kg·d))90 d后,分别检测大鼠尿液骨吸收指标(脱氧吡啶啉、钙、磷)、血清骨吸收指标(抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K)、血清骨生成指标(骨源性碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型前胶原羧基端前肽)以及血清骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB,RANK)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)含量。结果:鲫鱼卵唾液酸糖蛋白能显著降低骨质疏松症大鼠尿液脱氧吡啶啉(P<0.01)、钙(P<0.01)、磷(P<0.01)含量和血清抗酒石酸酸性磷酸酶(P<0.01)、组织蛋白酶K(P<0.01)活性,防止大鼠骨吸收;显著降低血清骨源性碱性磷酸酶(P<0.01)活性和骨钙素(P<0.01)、Ⅰ型前胶原羧基端前肽(P<0.01)含量,抑制大鼠高骨转换速率;显著上调OPG(P<0.01)含量,下调RANKL(P<0.01)含量,降低RANKL/OPG比值,抑制破骨细胞增殖分化,降低骨吸收。结论:鲫鱼卵唾液酸糖蛋白具有改善去卵巢大鼠骨质疏松症的作用,其作用机理可能与下调RANKL/OPG比值有关。

去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的优化表达及亲和常数的测定

目的:表达及纯化抗去唾液酸糖蛋白受体(ASG-PR)的单链抗体的可溶性,并测定其亲和常数。方法:用噬菌体C1克隆感染E.coliHB2151,挑取单个菌落接种于2×TY培养基中,于37℃震荡培养过夜。将培养物作1∶100稀释并转种后,用终浓度为0.25、0.5、1.0mmol/L的IPTG,分别在37℃、25℃和20℃下诱导表达过夜。取其培养上清,用饱和硫酸铵沉淀后,以120g/LSDS-PAGE分析。另外,将饱和硫酸铵沉淀物用30mLPBS重新溶解、透析除盐后,用Ni2+螯合柱进行纯化,再以120g/LSDS-PAGE鉴定纯化scFvC1的纯度。用非竞争酶免疫法测定scFv的亲和常数。结果:用0.5mmol/LIPTG在25℃诱导过夜,表达的scFvC1的量较多,其相对分子质量(Mr)约为28000,以可溶性的形式存在于培养基中。通过Ni2+亲和柱纯化后scFvC1的纯度在95%以上,产量约为0.8mg/L。scFv的亲和常数为(2.31±0.36)×10-7mol/L。结论:以筛选的C1噬菌体感染E.coliHB2151后可表达低亲和力的可溶性scFv,对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。

肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的流式细胞分析

建立肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体 (ASGPR)的流式细胞分析方法 (FCM ) ,对正常及损伤鼠肝细胞、肝癌细胞 (BEL 740 2 )表面的ASGPR作同步比较分析 .以异硫氰酸荧光素标记的新半乳糖白蛋白 (FITC NGA)为ASGPR的特异性配体 ,以培养的正常肝细胞 (L 0 2 )为靶细胞 ,建立肝细胞表面ASGPR的FCM .测定并计算正常及损伤鼠肝细胞 ,BEL 740 2细胞与同一浓度的FITC NGA同步反应后的平均荧光强度 (MIF)值 .FITC NGA与L 0 2细胞表面ASGPR趋近饱和结合的浓度为 0 4mg/L ,该浓度下正常及损伤鼠肝细胞 ,BEL 740 2细胞的MIF值分别为 2 2 8 7、 5 81、 1 13.该结合可以被至少 5 0倍于FITC NGA的NGA或10mmol/L的EDTA完全抑制 .FCM能够良好地揭示FITC NGA同ASGPR之间的受配体结合特性 .该方法证实BEL 740 2细胞表面几乎没有ASGPR ,损伤鼠肝细胞表面ASGPR的数量较正常鼠肝细胞显著减少 .

去唾液酸糖蛋白受体介导的肝脏靶向性研究进展

去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)又称半乳糖受体,主要表达于哺乳动物肝窦状隙的肝实质细胞表面,参与多种生理功能。多年来ASGPR一直被用于介导药物和基因的肝靶向递送以及肝脏成像等方面的研究,目前已取得许多进展。ASGPR介导的药物肝靶向递送研究主要集中在抗肿瘤药物、降胆固醇药物等。基因肝靶向递送多见于反义药物。肝脏成像研究包括评价肝脏功能、鉴别肝细胞肝癌和肿瘤肝转移灶等。近年来ASGPR的靶向性应用研究还进一步扩展到肝细胞立体培养、肝细胞筛选及肝细胞移植等领域。本文就这些内容作一综述。

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用

从鲫鱼卵中提取唾液酸糖蛋白,并探讨其对免疫功能低下小鼠免疫功能的作用。Balb/c小鼠连续皮下注射氢化可的松造成免疫功能低下模型,以不同剂量的鲫鱼卵唾液酸蛋白灌胃28d后,分别测定小鼠的抗体产生水平、T细胞免疫功能、非特异性免疫功能和血清IFN-γ/IL-4。结果显示,高剂量的鲫鱼卵唾液酸糖蛋白能显著升高免疫低下小鼠的血清溶血素水平(p<0.01)和抗体细胞生成数(p<0.01),增强脾淋巴细胞增殖能力(p<0.01)和迟发型变态反应(p<0.05),显著提高腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数(p<0.01),改善碳廓清能力(p<0.05)并升高血清中IFN-γ/IL-4水平(p<0.01)。说明鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对免疫功能低下小鼠具有显著的免疫调节作用。

乙型肝炎病毒X蛋白与去唾液酸糖蛋白受体2突变体相互作用的研究

目的:筛选并克隆鉴定人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,明确HBxAg在HBV感染及致癌过程中的具体作用。方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出阳性目的片段并测序,进行生物信息学分析。根据Genbank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录出去唾液酸蛋白受体2(ASGPR2)突变体的完整序列,克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀再次证明HBxAg与ASGPR2突变体的结合作用。结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能分解X-α-半乳糖(X-α-gal)变成蓝色的真阳性菌落41个,其中有一个是ASGPR2的新突变体。HepG2细胞的mRNA中能逆转录出ASGPR2的全基因序列, 体外免疫共沉淀结果证实该突变体与HBxAg在体外也有结合作用。结论:成功克隆出HBxAg的肝细胞结合蛋白,发现一新的ASGPR2突变体,并证实HBxAg与ASGPR2突变体在体外及酵母细胞内均有结合作用。

肝去唾液酸糖蛋白受体显像:三维分段肝功能评估的前景

去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是哺乳动物肝细胞表面的特异性受体,肝硬化和肝癌时ASGPR水平下降。利用99mTcGSA进行该受体的显像,能够得到HH15、LHL15、[R]0、R0等指标用于肝功能的评估;将这种功能性显像与单光子发射型计算机断层显像(SPECT)技术相结合,可以模拟肝脏切除的范围,并预测术后剩余肝脏的功能。此技术在国际上是一个新的课题,在国内尚无开展,用它来数字化的评估手术风险对患者手术方式的选择及预后具有重要影响。笔者结合正在进行的这方面部分研究,向读者作一介绍,以期在临床上发挥更好的作用。

中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体糖基结合域的原核表达与多克隆抗体的制备

目的:构建中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1和H2亚基糖基识别域(CRD)的原核表达质粒,体外表达纯化后制备多克隆抗体。方法:RT-PCR扩增出中国旱獭肝组织中ASGPR CRDH1和CRDH2 cDNA,将其克隆至原核表达载体pRSET-B中,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内诱导表达。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附试验、Western blot及免疫组织化学检测抗体的灵敏度和特异性。结果:成功构建了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域原核表达质粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2,目的蛋白可以高效表达,用其免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论:首次成功表达了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域多肽,且纯度高,免疫原性强,用其免疫小鼠获得的多克隆抗体特异性好、效价高,为在HBV感染模型-中国旱獭体内进行肝脏疾病的靶向治疗奠定了实验基础。

运用去唾液酸糖蛋白受体定量评估肝脏储备功能体系的建立

目的 肝脏去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)指标结合吲哚氰绿储留率(ICGR_(15))建立综合评估肝脏储备功能的体系。方法 测定不同比例肝脏切除大鼠模型肝脏ASGPR的HH_(15)、LHL_(15)和MRI结合ICGR_(15),建立一个综合定量评估肝脏储备功能的评分体系。结果 在正常肝脏容量丢失15％时,HH_(15)、LHL_(15)、MRI、ICGR_(15)等均不能显著反映出肝脏储备功能的变化,而涵盖上述指标的综合评估体系Y值(肝脏功能残余量)则能显著反映肝脏储备功能的变化。结论 涵盖HH_(15)、LHL_(15)、MRI及ICGR_(15)等指标的回归方程Y=2.56+33.188×MRI-44.844×HH_(15)+24.032×LHL_(15)-34.915×ICGR_(15)中的Y值是评估肝脏储备功能的敏感指标,能够对四氯化碳肝硬化大鼠模型的肝脏储备功能作出准确可靠的定量评估。

去唾液酸糖蛋白受体的研究现状

去唾液酸糖蛋白受体（ asialoglycoprotein receptor ， ASGPR），也被称为肝细胞半乳糖/N-乙酰基葡糖胺受体，或者 Ashwell-Morell 受体[1]。它主要表达于肝窦状间隙的肝实质细胞表面，是第一个被发现的凝集素。由于它结合配体的钙离子依赖性，因此属于 C 型凝集素。ASGPR 能够介导去唾液酸化的糖蛋白被肝细胞内吞降解[2]。目前已知的ASGPR 的配体非常多，提示其在糖蛋白代谢、脂代谢、凋亡细胞降解、调节凝血、介导病毒进入细胞和自身免疫性炎症反应等多个生理环节均发挥着重要的作用[3]。

基于去唾液酸糖蛋白受体的循环肝癌细胞磁性分选检测法及其改良

目的:介绍一种肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)富集和检测系统,并对该系统进行改良,以提高循环肿瘤细胞的检出率.方法:去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)是一种特异表达于肝实质细胞膜的跨膜蛋白.我们建立了一种基于ASGPR的磁性分选和Heppar1免疫鉴定的循环肝癌细胞富集和计数系统.首先以生物素化去唾液酸胎球蛋白作为配体与肝癌细胞结合,然后用抗生物素抗体磁珠进行间接磁性标记,从而磁性捕获循环肝癌细胞,接着用Heppar1进行免疫荧光染色鉴定,并对阳性细胞进行计数.文献报道和实际操作中发现,检测过程中采用肝素抗凝会引起细胞悬液中出现凝胶,影响细胞通过分离柱,降低分离效率.我们将部分步骤改用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)替代肝素抗凝,采用Hep3B肝癌细胞掺入试验对两种方法回收情况进行比较.结果:部分步骤改用EDTA抗凝后,细胞悬液中未出现凝胶现象.细胞掺入试验显示,5mL健康志愿者外周血中分别掺入10、30、90、270和810个Hep3B细胞,在每个掺入水平,改良法Hep3B细胞的平均回收率均≥70%,回收效率明显增加(P<0.05).结论:基于ASGPR的循环肝癌细胞富集和计数系统是一种具有临床应用潜能的循环肝癌细胞检测方法.经改良后能够有效消除细胞悬液中凝胶形成的现象,肝癌细胞回收效率较原检测法明显提高.

应用去唾液酸糖蛋白受体及临床指标建立肝储备功能定量评估系统

目的探讨应用肝细胞表面ASGPR流式细胞分析及临床指标建立肝储备功能定量评估系统,并与Child-Pugh评分进行比较,了解其在患者术前肝储备功能评估中的临床应用价值。方法选择32例肝占位病变行肝部分切除术患者,术前检测ICGR15与EHBF、R值与K值以及临床生化指标、Child-Pugh评分,以此作为自变量(Xn),以肝组织标本PHCASGPR+为因变量(Y),通过多元线性回归分析,建立肝储备功能定量评估系统,并与Child-Pugh评分进行比较,了解两种方法预测术后肝功能代偿情况的准确率。按照回归方程计算46例肝占位病变接受肝部分切除术及肝硬化并门脉高压症接受断流术患者肝储备功能定量值,评估肝储备功能情况,预测术后肝功能恢复情况,比较术前不同Child-Pugh分级与Y值患者术后肝功能恢复情况。结果在预测术后肝功能代偿良好准确率方面,Y值优于ChildPugh分级(P=0.030);而在预测术后肝功能代偿不良准确率方面,Y值与Child-Pugh分级无统计学差异(P=1.000)。结论新肝储备功能定量评估系统能一定程度提高肝切除或肝硬化患者术前肝储备功能评价准确度,具有临床应用价值。

抗去唾液酸糖蛋白受体抗体在慢性肝炎的分布差别研究

目的检测慢性乙型肝炎(简称慢性乙肝)、慢性丙型肝炎(简称慢性丙肝)患者和健康人群血清中抗去唾液酸糖蛋白受体抗体(anti-ASGPR)水平,观察anti-ASGPR与肝炎患者疾病发展的关系。方法选取HBV感染患者60例(慢性乙肝患者30例,慢性乙肝后肝硬化患者30例)、HCV感染患者60例(慢性丙肝患者30例,慢性丙肝后肝硬化患者30例),60例健康体检者为对照组,检测所有研究对象血清中anti-ASGPR、ALT的水平。结果 (1)HBV、HCV感染组血清anti-ASGPR水平均比对照组明显增高,差异均有统计学意义(P<0.01)。慢性乙肝后肝硬化组血清anti-ASGPR水平明显比慢性乙肝组高,差异有统计学意义(P<0.05)。慢性丙肝后肝硬化组血清anti-ASGPR水平明显比慢性丙肝组高,差异有统计学意义(P<0.05)。anti-ASGPR与ALT值无相关性。(2)丙肝组anti-ASGPR血清学水平明显高于乙肝组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论检测anti-ASGPR有助于临床的鉴别诊断,对治疗和预后具有重要的意义。

去唾液酸糖蛋白受体抗体阳性的Ⅰ型自身免疫性肝炎生物学性状及其意义

目的:探讨去唾液酸糖蛋白受体抗体(Auto-antibodies to asialoglycoprotein receptor,anti-A S G P R)阳性和阴性Ⅰ型自身免疫性肝炎(type Iauto-immune hepatitis AIH-Ⅰ)在临床、生化、免疫学、遗传学、组织学特点及其治疗应答反应的差异.方法:应用酶联免疫分析法(ELISA)检测79例确诊的AIH-Ⅰ患者血清中anti-ASGPR,将其分为anti-ASGPR阳性组及阴性组.结果:患者中anti-ASGPR阳性的百分比为75%,阳性患者(n=59)中,男性(n=7),女性(n=52),平均年龄(49.1±8.6)岁;阴性患者(n=20)中,男性(n=2),女性(n=18),平均年龄(47.1±7.9)岁,阳性患者与阴性患者在年龄、性别、ALT、AST、ALP、GGT、ANA、S M A、D R3、D R4比较差异无统计学意义,而在IgG、补体C3水平,组织学炎症活动及纤维化程度、治疗应答方面有统计学意义(P<0.05).结论:anti-ASGPR与AIH-Ⅰ患者炎症活动及病理改变存在一致性,且其对治疗应答有一定的提示.