α2,8-唾液酸转移酶Ⅵ过量表达影响小鼠乳腺癌细胞基因表达的研究

研究α2,8-唾液酸转移酶Ⅵ(Sixth type ofα2,8-sialyltransferase,ST8Sia Ⅵ)对乳腺癌细胞生物学功能的影响及其作用的分子机制。采用全基因组芯片技术检测ST8Sia Ⅵ过表达前后小鼠乳腺癌细胞4T1基因表达谱的差异;利用PathwayExplorer分析ST8Sia Ⅵ过表达前后对基因网络的影响。实验结果表明:ST8Sia Ⅵ过表达引起201个基因表达有差异,其中22个基因与肿瘤细胞的黏附、生长、运动、免疫和周期有关。另外,PathwayExplorer分析结果显示,差异表达基因涉及的最显著变化的基因网络是"依赖β-arrestin的G蛋白偶联受体(GPCR)信号通路";进一步的实验结果证明该通路下游Raf蛋白的磷酸化水平在ST8Sia Ⅵ过表达细胞显著升高。上述结果为ST8Sia Ⅵ生物学功能的深入研究提供了前提。

血清IgG唾液酸化修饰在肝棘球蚴病诊断中的应用研究

目的探索血清IgG唾液酸化修饰在肝棘球蚴病诊断及鉴别中的应用价值。方法采集西藏自治区、甘肃省、四川省、青海省2014—2016年的98例肝细粒棘球蚴病患者和29例肝多房棘球蚴病患者血样,广西医科大学附属医院2017年1—12月的30例肝癌住院患者血样,广西医科大学体检科22份健康体检者血样。提取各组血样的血清,每份50μl,采用基于荧光色谱的糖组学技术对血清中IgG的唾液酸化修饰进行定量分析。使用Protein G琼脂糖纯化试剂盒分离纯化血清中的IgG。取50μg纯化后的IgG样品,在25 mmol/L二硫苏糖醇溶液和50 mmol/L碘乙酰胺溶液中进行还原烷基化反应后加入1μl N‑糖苷酶缓冲液,酶解后采用石墨化碳小柱进行糖链的富集并将其冷冻干燥后溶于二甲基亚砜和冰醋酸的7∶3(v/v)混合溶液中,快速加入5 mmol/L的2‑氨基苯酰胺溶液和10 mmol/L氰基硼氢化钠溶液各50μl,反应2 h后,使用石墨碳小柱纯化。将标记后的糖链在Waters Acquity UPLC(H‑Class)系统上进行亲水色谱柱分离,荧光检测器设置的激发和发射波长分别为330 nm和420 nm,分析样品的单唾液酸化修饰、双唾液酸化修饰以及总唾液酸化修饰。采用Empower 3软件进行数据收集和处理,SPSS 25进行数据统计分析,数据的比较采用D’Agostino&Pearson omnibus正态分布检验(P1值)与单因素方差分析检验(P2值),两两之间的比较采用Tukey’s multiple comparisons test分析(P3值)。结果IgG糖链的色谱图共检测到21个IgG糖链峰,其中单唾液酸化修饰糖链5种,分别为FA2BG1S1(17.79 min)、A2G2S1(19.02 min)、A2BG2S1(20.02 min)、FA2G2S1(20.27 min)和FA2BG2S1(21.13 min);双唾液酸化修饰糖链4种,分别为A2G2S2(22.70 min)、A2BG2S2(23.29 min)、FA2G2S2(23.78 min)和FA2BG2S2(24.26 min)。各组血清样品各类唾液酸化修饰的含量均具有正态分布特性(P1>0.1)。肝细粒棘球蚴病组、肝多房棘球蚴病组血清IgG单唾液酸化修饰含量分别为(14.15±2.89)%和(10.24±2.97)%,双唾液酸化修饰含量分别为(3.02±0.98)%和(1.92±0.65)%,总唾液酸化修饰含量分别为(17.25±3.69)%和(12.27±3.65)%,均低于健康对照组的(16.55±2.95)%、(3.71±1.04)%和(20.26±3.79)%(F=23.70、11.14、22.98,均P2<0.0001)。其中肝细粒棘球蚴病组与肝多房棘球蚴病组相比,单唾液酸化修饰、双唾液酸化修饰和总唾液酸化修饰含量差异有统计学意义(t=6.352、4.701、6.392,P3<0.0001)。利用受试者工作曲线(ROC)进行了IgG唾液酸化修饰潜在诊断性能的评估,肝细粒棘球蚴病组与肝多房棘球蚴病组间AUC为0.829(95%CI:0.738~0.921),灵敏度和特异性分别为82.7%和87.7%。肝癌组的血清IgG的单唾液酸化修饰、双唾液酸化修饰和总唾液酸化修饰含量分别为(15.09±2.68)%、(3.28±1.30)%和(18.37±3.69)%,与肝多房棘球蚴病组的差异有统计学意义(t=6.587、4.318、6.372,P3<0.0001),肝多房棘球蚴病组和肝癌组间IgG总唾液酸化修饰ROC的AUC为0.881(95%CI:0.793~0.963),灵敏度和特异性分别为86.7%和93.1%。结论本研究发现了血清IgG唾液酸化修饰可能与肝棘球蚴病的发病机制有关,在肝棘球蚴病诊断,肝细粒棘球蚴病与肝多房棘球蚴病、肝癌与肝多房棘球蚴病的鉴别研究中具有一定的应用价值。

日本脑炎病毒NS1蛋白致脑血管内皮细胞损伤研究

[目的]本试验旨在探究日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)非结构蛋白NS1的生物学功能。[方法]将JEV NS1基因克隆到pFastbac1载体并将其转化至感受态DH10Bac得到重组杆粒,将重组杆粒转染sf9细胞产生重组杆状病毒,通过病毒感染High5细胞成功表达了JEV NS1。在人脑微血管内皮细胞(HBMEC)培养液添加外源NS1蛋白,通过光学显微镜观察细胞形态,利用共聚焦显微镜观察JEV NS1蛋白对HBMEC表面唾液酸修饰的影响,IFA检测细胞中组织蛋白酶L的表达;小鼠经尾静脉注射JEV NS1及其N207糖基化位点突变体蛋白NS1 N207Q,分别于24、48和72 h通过伊文思蓝(EB)染色检测2个蛋白对小鼠的血脑屏障(BBB)通透性的影响。[结果]JEV NS1蛋白通过下调人脑内皮细胞表面的唾液酸修饰和上调组织蛋白酶L表达损伤内皮糖萼;动物试验表明NS1蛋白能够破坏小鼠的血脑屏障;NS1 N207Q蛋白处理对细胞表面唾液酸修饰的影响不显著,体内处理对小鼠的血脑屏障无明显损伤。[结论]JEV NS1蛋白具有损伤人脑微血管内皮细胞的生物学功能,突变N207位点可导致其损伤功能减弱,可为JEV亚单位疫苗候选抗原的优化提供新思路。

离子交换色谱对抗VEGFR2单抗的电荷异质性分析

目的采用离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)分析抗VEGFR2(抗血管内皮生长因子受体2)单抗制品的电荷异质性。方法应用CEX-HPLC技术,对VEGFR2单抗进行电荷异质性分析,并结合羧肽酶B(CpB)和N-糖酰胺酶F(EndoF2)酶切,初步研究其电荷异质性的成因。结果用CEX-HPLC分析CpB酶切前后单抗,证明其碱性变异体主要由C末端赖氨酸不均一性引起;分析EndoF2酶切前后处理的单抗,证明其酸性变异体部分由N-糖末端上的唾液酸修饰所引起。通过2种酶的顺序酶切可相对准确地分析含C-末端赖氨酸以及含唾液酸单抗的比例。结论采用CEX-HPLC可较好地分析单抗的电荷异质性;并结合合适的酶切处理,可判断单抗主要电荷异质性的来源,为保证单抗制品生产工艺的稳定性及质量控制提供了有效手段。

成像毛细管等点聚焦电泳法对单克隆抗体制品的电荷异质性分析

目的:采用成像毛细管等点聚焦电泳法分析单克隆抗体制品的电荷异质性。方法:应用优化的成像毛细管等点聚焦电泳技术,对2种单克隆抗体制品酶切处理前后进行电荷异质性分析。结果:羧肽酶B处理前后的抗体1成像毛细管等点聚焦电泳结果比较证明其电荷异质性主要由C末端赖氨酸不均一性引起;羧肽酶B处理和/或N-糖苷酶处理前后的抗体2成像毛细管等点聚焦电泳结果比较证明其电荷异质性主要由C末端赖氨酸不均一性和N-糖的唾液酸修饰引起。结论:采用优化的成像毛细管等点聚焦电泳技术,可较好地分析单克隆抗体产品的电荷异质性;并且配合合适的酶切处理,可判断单克隆抗体产品主要电荷异质性的来源,为保证单克隆抗体产品技术药物生产工艺的稳定性及质量控制提供了有效手段。