鹧鸪禽流感病毒和人流感病毒唾液酸受体分布特征

目的探讨鹧鸪禽流感病毒和人流感病毒唾液酸受体分布特点及其作用。方法用亲和组化法检测鹧鸪呼吸道与消化道流感病毒唾液酸受体的分布,荧光素Alexa488标记禽流感病毒H9N1和人流感病毒H1N1,分别与鹧鸪呼吸道、消化道各解剖部位组织细胞结合。结果鹧鸪呼吸道同时表达SAα-2,3Gal和SAα-2,6Gal两种受体,但其消化道仅表达SAα-2,3Gal受体。SAα-2,3Gal受体在鹧鸪呼吸道各部位和消化道结肠上皮细胞呈强阳性弥漫分布;SAα-2,6Gal受体在呼吸道气管、支气管和次级支气管呈强阳性弥漫分布,而副支气管、消化道结肠均为缺乏或仅表达极少量。H9N1禽流感病毒与鹧鸪呼吸道各部位和消化道结肠均结合;人流感病毒H1N1与鹧鸪的气管、支气管、次级支气管结合,但未见与副支气管和结肠结合,此结果与鹧鸪呼吸道和消化道SAα-2,3Gal和SAα-2,6Gal受体分布总体一致。结论鹧鸪同时表达SAα-2,3Gal和SAα-2,6Gal受体,能与禽流感病毒和人流感病毒结合,有助于禽流感病毒与人流感病毒基因重配,提示其可充当流感病毒潜在的中间宿主。

SPF鸡各组织中流感病毒唾液酸受体的分布

为了解SPF鸡体内各组织中流感病毒唾液酸受体分布状况,本研究采用凝集素免疫荧光组织染色的方法,系统检测了流感病毒唾液酸受体在SPF鸡呼吸系统、消化系统以及其它系统各组织中的分布,并进行半定量分析。结果表明,大部分组织中均同时存在唾液酸α2,3-半乳糖受体与唾液酸α2,6-半乳糖受体,只有少部分组织仅存在其中一种受体,这种受体分布的广泛性与流感病毒组织噬性相一致;但鼻甲与喉头中唾液酸受体明显低于许多其他组织,这也表明不能简单的通过唾液酸受体的有无或者密度高低来判定病毒在各组织中的实际分布与复制增殖情况,或许还有其他机制参与了病毒入侵与增殖的过程。

12株H9N2亚型禽流感病毒与Sia-α-2,6-唾液酸受体结合力的变化研究

为分析H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)对Sia-α-2,6-唾液酸受体(Sia-α-2,6-Gal)结合力的变化趋势,选择2001~2013年分离自山东省的12株H9N2 AIV进行研究。利用同源建模、分子动力学和分子对接等计算方法,对12株H9N2 AIV的HA蛋白与Sia-α-2,6-Gal之间相互作用进行系统研究,筛选HA蛋白中与Sia-α-2,6-Gal结合的关键氨基酸,并对关键氨基酸进行饱和突变研究。结果显示:随着分离年代临近,H9N2 AIV对Sia-α-2,6-Gal亲和能力有增强趋势,Thr198、Leu234、Met235位点的某种氨基酸突变能够大幅提高HA蛋白与Sia-α-2,6-Gal的结合能力。推测H9N2 AIV对哺乳动物感染能力呈逐渐增强趋。

唾液酸受体并非流感病毒各亚型在雪貂组织中播散分布的决定因子

目的探讨流感病毒在雪貂组织中的分布与唾液酸受体的关系。方法用病毒分离的方法分析流感病毒H5N1(SZ406H,A/VN/1203/04),SH1N1,H3N2(Brisbane/09,HK/09)在雪貂各组织中分布,用直接免疫荧光法分析雪貂各组织的唾液酸受体的分布,并通过体外实验证实活病毒与组织上受体的结合。结果 H5N1(SZ)和H5N1(A/VN/1203/04)在雪貂的肝、脾、肺、肠中有分布,H5N1(A/VN/1203/04)在脑组织中也有分布,而SH1N1、H3N2(Brisbane/09,HK/09)只分布于肠组织。而唾液酸受体SAα2,6Gal和SAα2,3Gal的I型受体分布于脾、心、肺、肠、脑组织中,和SAα2,3Gal II型受体分布于肝、脾、心、肺、肠、脑组织。SH1N1病毒与SAα2,6Gal能结合,而H5N1与SAα2,3Gal结合。结论 H5N1能在雪貂的多器官组织组织中分布和繁殖,而H3N2和SH1N1仅能在肠组织中分布繁殖。SAα2,6Gal和SAα2,3Gal受体在雪貂多器官组织中均有表达,说明唾液酸受体是病毒进入的门户,但不是病毒分布的决定因子。

唾液酸受体在家禽肾和生殖系统组织中的表达

为了观察流感病毒唾液酸α2,3-半乳糖和唾液酸α2,6-半乳糖两种受体在鸡、鸭两种家禽肾脏和生殖系统组织中分布和表达的特征,本研究利用凝集素免疫荧光组织染色方法对各器官组织进行了系统的定性分析。结果显示,唾液酸α2,3-半乳糖和唾液酸α2,6-半乳糖这两种受体在鸡、鸭肾脏和生殖系统中皆有分布,其中唾液酸α2,3-半乳糖的分布更为广泛。这一研究结果提示,鸡、鸭肾脏和生殖系统组织细胞对禽流感病毒和人流感病毒都存在易感的基础,且更容易感染禽源的流感病毒。

鹅流感病毒唾液酸受体分布特点及病毒吸附模式

目的:探讨鹅流感病毒唾液酸(SA)受体分布特点、病毒吸附模式及其作用。方法:凝集素组织化学法检测鹅呼吸道和消化道流感病毒SA受体的分布,荧光素Alexa488标记禽流感病毒H9N1和人流感病毒H1N1吸附鹅呼吸道和消化道组织。结果:鹅呼吸道和消化道以表达SAα-2,3半乳糖(Gal)受体为主,SAα-2,3Gal受体在鹅呼吸道气管、支气管、次级支气管和副支气管、消化道结肠以及泄殖腔呈阳性表达,而SAα-2,6Gal受体缺乏或仅弱表达。禽流感病毒H9N1吸附鹅呼吸道气管、支气管、次级支气管和副支气管、消化道结肠以及泄殖腔,但人流感病毒H1N1仅少量病毒吸附副支气管、结肠以及泄殖腔。结论:鹅呼吸道和消化道同时表达SAα-2,3Gal受体,有助于禽流感病毒复制部位由消化道扩展到呼吸道以及各亚型禽流感病毒之间的基因重配,提示鹅在禽流感病毒的起源和进化中可能起重要作用。

小鼠及大鼠原代肥大细胞表面唾液酸受体的表达

肥大细胞(MC)是机体重要的效应性和调节性免疫细胞,为研究流感病毒唾液酸受体在肥大细胞表面的表达情况,我们建立了小鼠和大鼠皮肤、腹腔、肺脏原代肥大细胞的分离、纯化、鉴定方法。通过植物凝集素免疫荧光染色的方法对肥大细胞表面唾液酸受体的表达情况进行定性检测。结果发现,小鼠、大鼠的腹腔和肺脏原代肥大细胞同时表达SAα2,3Gal和SAα2,6 Gal两种常见的流感病毒唾液酸受体,即同时表达禽流感病毒受体和人流感病毒受体。

唾液酸受体在大鼠肠黏膜微血管内皮细胞中的表达

肠黏膜微血管内皮细胞在肠道中广泛存在,为研究流感病毒唾液酸α2,3 半乳糖(SAα2,3Gal)和α2,6 半乳糖(SAα2,6Gal)两种受体在肠黏膜微血管内皮细胞表面的表达情况,本试验利用植物凝集素免疫荧光染色方法和流式细胞术分别进行了定性和定量分析。结果显示,大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIM-MVECs)表面同时表达唾液酸α2,3-半乳糖和α2,6-半乳糖两种受体,即同时表达人流感病毒受体和禽流感病毒受体,并且唾液酸α2,6 半乳糖的表达量显著高于α2, 3半乳糖受体的表达量。该试验结果表明,RIM-MVECs 可以被人源和禽源流感病毒感染,且更易被人源流感病毒感染。

犬体内唾液酸受体的组织分布及对H3N2亚型犬流感病毒的易感性研究

目的测定犬体不同组织器官内流感病毒受体的类型和分布差异,验证犬对H3N2亚型犬流感病毒的易感性。方法采集健康英国史宾格犬的不同组织器官,利用凝集素免疫荧光组织染色方法,检测组织内人型流感病毒唾液酸受体唾液酸α2,6-半乳糖(SAα2,6Gal)和禽型流感病毒唾液酸受体唾液酸α2,3-半乳糖(SAα2,3Gal)类型与分布;用H3N2亚型犬流感病毒人工感染英国史宾格犬,采集不同组织器官,用免疫组织化学染色法进行病毒的组织分布差异性分析。结果多种组织器官中同时存在着SAα2,6Gal和SAα2,3Gal两种类型的受体,少数组织器官中存在单一受体;SAα-2,6Gal受体在分布的广泛性、在同一器官中的表达量上高于SAα-2,3Gal型受体。人工感染后,病毒分布量与受体量整体趋势基本一致,仅在个别器官中存在差别。结论禽型和人型流感病毒受体广泛分布于犬的各个组织器官,犬具备同时感染禽型和人型流感病毒的分子基础。

流感病毒唾液酸受体在人、小鼠、鸡及鸭气管和肺组织分布的定性与定量分析

为了准确地检测流感病毒唾液酸α2,3-半乳糖和唾液酸α2,6-半乳糖两种受体在人、小鼠、鸡及鸭气管和肺组织中分布和表达的特征,本研究利用凝集素免疫荧光组织染色方法对各种组织切片进行了系统的定性和定量分析.定性分析的结果,显示两种流感病毒唾液酸受体在人、小鼠、鸡及鸭肺组织和小鼠及鸭气管组织中均有表达,但是,唾液酸α2,6-半乳糖受体只在人气管组织中有表达而唾液酸α2,3-半乳糖受体只在鸡气管组织中有表达.定量分析的结果显示,两种流感病毒唾液酸受体在人和小鼠的气管组织以及人、鸡和鸭的肺组织均有表达.同时,本研究结果还显示了流感病毒受体在同一组织中的分布和表达并不是均匀的,表明它们在各种组织中的分布和表达并非简单的有和无之间的区别,而是一种在表达数量上多和少的差别.

去唾液酸糖蛋白受体介导甘草次酸壳聚糖微球的质量评价

目的:甘草次酸具有多种药理作用,如抗肿瘤、抗炎和抗病毒等。对甘草次酸进行修饰,制成靶向缓释制剂可以使药物准确到达作用部位,降低对其他组织的伤害。实验制备去唾液酸糖蛋白受体介导的甘草次酸壳聚糖微球,并对所制备的微球进行表征和质量评价。方法:采用乳化交联法制备,并对壳聚糖微球的粒径、Zeta电位、红外光谱图、包封率和载药量、体外释放度及稳定性等方面进行考察。结果:制备的微球粒径为1.106~1.718μm,Zeta电位为(15.13±1.76)mV,包封率为82.4%,载药量为1.02%,24 h体外释放度为77.09%,稳定性有待提高。结论:去唾液酸糖蛋白受体介导的甘草次酸壳聚糖微球,可为研制靶向肝药物提供一定的理论依据和实践基础。

流感病毒唾液酸受体在甲型流感病毒生态系统中的分布及其作用

水禽类被认为是甲型流感病毒的自然基因储存库，为人和低等动物各亚型流感病毒的来源。流感病毒唾液酸受体结合特异性在流感病毒种属范围限制中起重要作用。一般认为，水禽类仅表达SA2—3Gal受体，人表达SA2—6Gal受体为主，故人不易感染禽流感病毒和禽类不易感染人流感病毒；猪在流感病毒生态系统中是重要“基因混合器”，有助于新病毒株在人的流行，此外，流感病毒生态系统中间宿主的范畴可能还包括多种陆地禽类如鸡和鹌鹑。然而，最近研究结果表明人呼吸道除表达SA2-6Gal受体，下呼吸道也表达SA2—3Gal受体，为禽流感病毒从禽类跨种属传递给人提供分子学基础。本文就流感病毒唾液酸受体在生态系统的分布和作用的研究进展作一综述。

流感病毒唾液酸受体在哮喘小鼠气道组织的分布和表达

目的观察对比流感病毒唾液酸a2，3-半乳糖（SAa2，3-gal）和唾液酸a2，6-半乳糖（SAa2，6-gal）受体在哮喘小鼠气道组织中的分布和表达以及地塞米松干预对其表达的影响。方法30只BALB/c小鼠被随机分成正常组（N组）、哮喘组（A组）和地塞米松干预组（D组）。A组小鼠以卵蛋白（OVA）致敏后激发建立哮喘模型，D组激发前腹腔注射地塞米松，余同A组。行BALF细胞计数，ELISA测定BALF中IL-5浓度，HE染色观察肺组织病理学改变及气道炎症评分，AB-PAS染色观察黏液分泌，免疫组化法（IHC）观察肺组织Muc5ac蛋白表达，免疫荧光法观察各组小鼠气道组织中唾液酸受体分布和表达的差异。结果A组小鼠BALF嗜酸性粒细胞数、IL-5浓度、气道炎症评分、气道黏液分泌较N组小鼠均升高，而D组小鼠上述指标较A组降低。SAa2，3-gal和SAa2，6-gal受体在各组气道组织中均有表。SAa2，3-gal受体在哮喘组气道上皮细胞表达的平均阳性率较N组升高，SAa2，3-gal和SAa2，6-gal受体在D组气道上皮细胞分布和表达的平均阳性率均较N组和A组升高（P〈0.05）。结论哮喘组小鼠气道上皮SAa2，3-gal受体的表达增强；地塞米松上调SAa2，3-gal和SAa2，6-gal受体的表达。两者可能是哮喘患者对流感病毒易感性增强的原因之一。

去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的优化表达及亲和常数的测定

目的:表达及纯化抗去唾液酸糖蛋白受体(ASG-PR)的单链抗体的可溶性,并测定其亲和常数。方法:用噬菌体C1克隆感染E.coliHB2151,挑取单个菌落接种于2×TY培养基中,于37℃震荡培养过夜。将培养物作1∶100稀释并转种后,用终浓度为0.25、0.5、1.0mmol/L的IPTG,分别在37℃、25℃和20℃下诱导表达过夜。取其培养上清,用饱和硫酸铵沉淀后,以120g/LSDS-PAGE分析。另外,将饱和硫酸铵沉淀物用30mLPBS重新溶解、透析除盐后,用Ni2+螯合柱进行纯化,再以120g/LSDS-PAGE鉴定纯化scFvC1的纯度。用非竞争酶免疫法测定scFv的亲和常数。结果:用0.5mmol/LIPTG在25℃诱导过夜,表达的scFvC1的量较多,其相对分子质量(Mr)约为28000,以可溶性的形式存在于培养基中。通过Ni2+亲和柱纯化后scFvC1的纯度在95%以上,产量约为0.8mg/L。scFv的亲和常数为(2.31±0.36)×10-7mol/L。结论:以筛选的C1噬菌体感染E.coliHB2151后可表达低亲和力的可溶性scFv,对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。

肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的流式细胞分析

建立肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体 (ASGPR)的流式细胞分析方法 (FCM ) ,对正常及损伤鼠肝细胞、肝癌细胞 (BEL 740 2 )表面的ASGPR作同步比较分析 .以异硫氰酸荧光素标记的新半乳糖白蛋白 (FITC NGA)为ASGPR的特异性配体 ,以培养的正常肝细胞 (L 0 2 )为靶细胞 ,建立肝细胞表面ASGPR的FCM .测定并计算正常及损伤鼠肝细胞 ,BEL 740 2细胞与同一浓度的FITC NGA同步反应后的平均荧光强度 (MIF)值 .FITC NGA与L 0 2细胞表面ASGPR趋近饱和结合的浓度为 0 4mg/L ,该浓度下正常及损伤鼠肝细胞 ,BEL 740 2细胞的MIF值分别为 2 2 8 7、 5 81、 1 13.该结合可以被至少 5 0倍于FITC NGA的NGA或10mmol/L的EDTA完全抑制 .FCM能够良好地揭示FITC NGA同ASGPR之间的受配体结合特性 .该方法证实BEL 740 2细胞表面几乎没有ASGPR ,损伤鼠肝细胞表面ASGPR的数量较正常鼠肝细胞显著减少 .

去唾液酸糖蛋白受体介导的肝脏靶向性研究进展

去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)又称半乳糖受体,主要表达于哺乳动物肝窦状隙的肝实质细胞表面,参与多种生理功能。多年来ASGPR一直被用于介导药物和基因的肝靶向递送以及肝脏成像等方面的研究,目前已取得许多进展。ASGPR介导的药物肝靶向递送研究主要集中在抗肿瘤药物、降胆固醇药物等。基因肝靶向递送多见于反义药物。肝脏成像研究包括评价肝脏功能、鉴别肝细胞肝癌和肿瘤肝转移灶等。近年来ASGPR的靶向性应用研究还进一步扩展到肝细胞立体培养、肝细胞筛选及肝细胞移植等领域。本文就这些内容作一综述。

肝去唾液酸糖蛋白受体显像:三维分段肝功能评估的前景

去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是哺乳动物肝细胞表面的特异性受体,肝硬化和肝癌时ASGPR水平下降。利用99mTcGSA进行该受体的显像,能够得到HH15、LHL15、[R]0、R0等指标用于肝功能的评估;将这种功能性显像与单光子发射型计算机断层显像(SPECT)技术相结合,可以模拟肝脏切除的范围,并预测术后剩余肝脏的功能。此技术在国际上是一个新的课题,在国内尚无开展,用它来数字化的评估手术风险对患者手术方式的选择及预后具有重要影响。笔者结合正在进行的这方面部分研究,向读者作一介绍,以期在临床上发挥更好的作用。

乙型肝炎病毒X蛋白与去唾液酸糖蛋白受体2突变体相互作用的研究

目的:筛选并克隆鉴定人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,明确HBxAg在HBV感染及致癌过程中的具体作用。方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出阳性目的片段并测序,进行生物信息学分析。根据Genbank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录出去唾液酸蛋白受体2(ASGPR2)突变体的完整序列,克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀再次证明HBxAg与ASGPR2突变体的结合作用。结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能分解X-α-半乳糖(X-α-gal)变成蓝色的真阳性菌落41个,其中有一个是ASGPR2的新突变体。HepG2细胞的mRNA中能逆转录出ASGPR2的全基因序列, 体外免疫共沉淀结果证实该突变体与HBxAg在体外也有结合作用。结论:成功克隆出HBxAg的肝细胞结合蛋白,发现一新的ASGPR2突变体,并证实HBxAg与ASGPR2突变体在体外及酵母细胞内均有结合作用。