啟良重楼内生真菌的分离鉴定及抑菌活性

【目的】从药用植物啟良重楼中分离鉴定内生真菌,研究其对常见病原细菌的抑菌活性,并分析其次级代谢产物,为利用传统药用植物内生菌开发新型抗生素药物提供新的思路。【方法】采用平板分离法分离纯化啟良重楼内生真菌,提取其基因组DNA,PCR扩增ITS序列并测序,鉴定内生真菌的种类;采用滤纸片法研究其次级代谢产物对12种供试菌的抑菌活性;采用GC-MS技术分析次级代谢产物的种类。【结果】从啟良重楼中分离了2株内生真菌,分别鉴定为Setophoma caverna CLZ1和Psilocybe sp.CLZ2;S.caverna CLZ1对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia ATCC 13883)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus ATCC 4698)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ATCC 10792)、多耐铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 43300,MRSA)等5种供试菌有中度敏感抑制作用,其最小抑菌浓度(MIC)为0.78~3.13 mg·mL^(-1);Psilocybe sp.CLZ2对MRSA有中度敏感抑制作用,其MIC值为3.13 mg·mL^(-1)。运用GC-MS从S.caverna CLZ1提取物中鉴定出36个化合物,包括吡啶(0.91%)、烟酰胺(0.61%)、邻苯二甲酸二丁酯(1.42%)、油酸甲酯(2.28%)和硬脂酸甲酯(0.83%)等5个抑菌活性化合物;从Psilocybe sp.CLZ2提取物中鉴定出44个化合物,包括吡啶(0.106%)和苯乙醇(0.073%)等2个抑菌活性化合物。【结论】从啟良重楼根茎中分离出内生真菌S.caverna CLZ1和Psilocybe sp.CLZ2,发现S.caverna CLZ1的次级代谢产物具有广抑菌谱,并从中鉴定出5个可能具有抑菌活性的次生代谢产物。

啟良重楼内生细菌的分离鉴定及其次级代谢产物研究

对抗生素产生耐药性的细菌引起的感染及自由基积累导致的氧化损伤对人类健康造成重大威胁,由于重楼属植物内生菌中含有抗菌、抗氧化等活性物质,因此本试验采用形态学和16S rDNA鉴定技术对啟良重楼内生细菌的种类进行鉴定;通过滤纸片法和DPPH自由基清除试验研究其体外抑菌和抗氧化活性,并运用GC-MS鉴定活性组分。结果表明,从啟良重楼根茎中分离鉴定出3株内生细菌:巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium CLX1,G^(+))、Lelliottia aquatilis CLX2(G^(-))、居中克吕沃尔氏菌(Kluyvera intermedia CLX3,G^(-));其中B.megaterium(CLX1)具有最佳抑菌活性,对3株革兰氏阴性菌和7株革兰氏阳性菌的抑菌圈范围为(10.39±0.24)mm~(13.44±0.10)mm,MIC范围为0.33~2.61 mg/mL;L.aquatilis(CLX2)的DPPH自由基清除能力最强,EC50值为1.276 mg/mL。采用GC-MS从内生细菌B.megaterium的活性次级代谢产物中鉴定出7种抑菌活性化合物:二甲基三硫、甲基甲烷硫代磺酸盐、甲基硫代磺酸甲酯、苯甲酸、环(脯氨酸-亮氨酸)二肽、正二十一烷、2,5-二叔丁基酚,从L.aquatilis鉴定出2种抗氧化活性化合物:2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、十六烷酸(棕榈酸)。本研究结果为从药用植物啟良重楼内生细菌中发掘抑菌、抗氧化天然活性物质及开发新型抗生素、解决氧化损伤问题提供了科学参考。

3种重楼属药用植物挥发性成分和抑菌活性研究

目的 比较3种5年生重楼属药用植物的挥发性成分和抑菌活性差异,为推动重楼资源在医药方面的开发和合理利用提供参考。方法 采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术研究七叶一枝花、啟良重楼、黑籽重楼3种重楼属药用植物提取物挥发性成分,采用滤纸片法研究3种提取物对11种供试菌的抑菌活性。结果 从七叶一枝花、啟良重楼、黑籽重楼中分别鉴定出33、29、22种挥发性成分,占其相对百分含量29.35%、30.13%、20.09%,三者相同挥发性成分14种;酯类化合物为主要挥发性成分,其中己二酸二(2-乙基己)酯含量最高,七叶一枝花、啟良重楼、黑籽重楼中分别为4.28%、4.94%、5.43%。七叶一枝花对苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌等4株供试菌有良好抑制效果,啟良重楼对苏云金芽孢杆菌、多耐铜绿假单胞菌、藤黄微球菌等3株供试菌有良好抑制效果,黑籽重楼对苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌2株供试菌有良好抑制效果。结论 3种重楼属药用植物提取物挥发性成分的组成和含量存在很大差异;对11株供试菌的抑菌效果依次为七叶一枝花、啟良重楼、黑籽重楼。

恩施地区三种重楼属植物活性成分与抗氧化活性研究

对比分析恩施地区3种重楼5年生七叶一枝花[Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch).Hara]、啟良重楼(Paris qiliangiana H.Li,J.Yang&Y.H.Wang)、黑籽重楼(Paris thibetica Franch.)中重楼皂苷Ⅱ活性成分含量,建立气相色谱法(GC)检测方法,检测3种重楼提取物DPPH自由基清除活性,研究其抗氧化能力。乙酸乙酯提取重楼皂苷Ⅱ,采用FID检测器,升温程序为0~3 min,60℃,3℃/min升至280℃,保持20 min;进样口温度310℃;载气为氮气(99.999%);流速为1.0 mL/min;进样量为5μL,不分流。结果表明,GC检测得到重楼皂苷Ⅱ标准品的标准曲线为Y=0.845X+72.18,在浓度512.5~16400.0 ng/μL范围内线性良好,R2>0.9995。方法检出限为40.5 ng/μL,定量限为130.6 ng/μL。加标回收率为96.93%~98.33%,RSD为2.72%。GC检测发现七叶一枝花中重楼皂苷Ⅱ含量为0.104 mg/g,黑籽重楼中为0.098 mg/g,啟良重楼中为0.015 mg/g。3种重楼提取物的IC_(50)从强到弱为七叶一枝花(2.372 mg/mL)、啟良重楼(2.461 mg/mL)、黑籽重楼(2.473 mg/mL)。该方法准确可靠,简便快捷且灵敏度高,适用于重楼皂苷Ⅱ含量的测定。恩施地区七叶一枝花中的活性成分重楼皂苷Ⅱ含量最高,其次是黑籽重楼,啟良重楼的含量最低。重楼提取物有一定的抗氧化能力,且七叶一枝花的抗氧化能力最强。