人喉上皮细胞的原代培养

目的探讨人喉上皮细胞的原代培养条件及其增殖、分化特点。方法采用低血清（２％）并添加促生长因子的培养基，对中晚期引产胎儿的喉粘膜进行组织块原代培养，并通过倒置显微镜、透射电镜、细胞角蛋白免疫组化染色观察原代培养细胞的特性。结果组织块接种成活率为（４７ ± １１）％，３ｄ后即可见生长晕， １０～ １４ｄ时汇合成片，细胞呈扁平、多角形，胞浆含张力原纤维，细胞间可见丰富的桥粒连结，细胞角蛋白表达阳性。结论本实验采用的培养条件适宜人喉上皮细胞的生长，所获细胞纯度高，培养过程简便；从生物学行为来看，体外培养的人喉上皮细胞同样具有增殖能力和分化潜能，是进行癌变研究的良好对象。

人乳头状瘤病毒E6和E7蛋白过表达慢病毒载体构建及稳定转染喉上皮细胞系的建立

目的分别构建过表达人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6型和11型的E6、E7癌基因的慢病毒载体,建立HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的SNU-1076喉上皮细胞系模型。方法分别合成表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的片段,构建重组慢病毒载体pHBLV-CMV-h-HPV6-E6-E7-3FLAG-ZsGreen-Puro和pHBLV-CMV-h-HPV11-E6-E7-3FLAG-ZsGreen-Puro。包装慢病毒后转染进入人喉上皮细胞系SNU-1076,经嘌呤霉素抗性筛选得到阳性克隆。采用实时定量PCR法分别检测HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的水平。结果通过测序验证质粒构建的成功。实时荧光定量PCR的结果显示,转染HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的SNU-1076细胞系相较于转染对照空载体的细胞系出现了明显的扩增曲线。其中HPV6-E6-E7的过表达效果为41692倍,HPV11-E6-E7的过表达效果为124957倍。结论利用慢病毒法成功分别建立了过表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7的喉上皮SNU-1076细胞系。

喉癌及胚胎喉上皮细胞超微结构初步观察

采用扫描和透射电镜对3例喉癌、3例胎喉上皮及2例成人声带上皮细胞的超微结构对照观察.发现喉癌细胞与早期胚胎喉非纤毛上皮细胞超微结构有许多相似性,故作者认为喉癌细胞可能是一种返祖细胞.

人喉上皮细胞的体外培养及生物学特性

目的建立一种有效的培养体系并提供一个研究人喉上皮细胞的体外模型。方法采用胎牛血清(2%)并添加促生长因子的培养基,对中晚期引产胎儿的喉黏膜进行组织块原代、传代培养,并通过倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜、细胞角蛋白免疫组化染色观察培养细胞的特性。结果组织块接种后3d即可见生长晕,10～14d时汇合成片,传代后24h即见细胞贴壁并开始增殖,约12d左右连接成片,可传代2～4代;组织块表层、深层细胞呈现不同的表现;培养细胞呈扁平、多角形,胞浆含张力原纤维,细胞间可见丰富的桥粒连接,细胞角蛋白表达阳性。结论本实验采用的培养方法和条件适宜人喉上皮细胞的生长;从生物学行为来看,体外培养的人喉上皮细胞来自于组织块的基底细胞和中间细胞,并与其来源细胞一样具有增殖能力和分化潜能,具有广阔的应用前景。

基因芯片筛选喉鳞状上皮细胞癌相关基因的初步研究

目的:应用基因芯片技术进行喉鳞状上皮细胞癌相关基因表达谱差异分析,筛选喉鳞状上皮细胞癌相关基因。方法:从4例喉鳞状上皮细胞癌中相同患者体内取喉鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织,应用含有人类全基因组的基因芯片进行分析。结果:在4例喉鳞状上皮细胞癌中共同基因表达显著差异的有349条,其中112条表达上调,237条表达下调。结论:基因芯片能提供大量喉癌相关基因表达谱的信息,分析这些差异表达的基因能够阐明喉鳞状上皮细胞癌复杂的生物学特性与基因表达之间的内在联系,并识别肿瘤的标记物,为进一步研究喉鳞状上皮细胞癌发生、发展相关基因打下基础。

喉癌组织中CD70的表达及其意义

目的探讨分化抗原簇70(CD70)在喉鳞状上皮细胞癌(LSCC)组织中的表达。方法利用CD70单克隆抗体,通过免疫组织化学技术对32例LSCC组织和22例正常声带组织标本进行免疫组织染色,探讨CD70在人喉癌组织中的表达。结果全部32例喉癌组织中CD均有表达,阳性率为100%;而在正常声带组织中仅有2例呈弱阳性表达,阳性率仅为9%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CD70在LSCC中高度表达,可能参与喉癌组织的抗肿瘤免疫活性。

基因芯片筛选喉鳞状上皮细胞癌相关基因的实验研究

目的:进行喉鳞状上皮细胞癌相关基因的验证研究,为喉鳞状上皮细胞癌相关基因的进一步研究打下基础。方法:在基因芯片筛选结果中挑出部分基因(SENP1、CD109、Lamininα2、Lamininα3),应用RT-PCR、Western blot进一步检测这些基因在12例喉鳞状上皮细胞癌及其癌旁正常组织中mRNA和蛋白水平的表达。结果:RT-PCR结果显示SENP1、CD109、Lamininα3基因在喉鳞状上皮细胞癌组织中表达上调,Lamininα2基因表达下调。Westernblot结果显示SENP1、CD109蛋白在喉鳞状细胞癌组织中的表达明显高于对应的癌旁正常组织。结论:SENP1、CD109、Lamininα2、Lamininα3可能与喉鳞状上皮细胞癌的发生、发展相关,这对从分子水平研究喉癌的发病机制提供了有益的线索。

基质金属蛋白酶及其抑制剂在喉鳞癌中的基因表达谱及临床病理特征相关性分析

目的分析喉鳞状上皮细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族及组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)的基因表达谱,找出与LSCC相关性最高的基因进行进一步研究,探讨其蛋白的表达与临床病理特征相关性。方法选取28例LSCC患者,采用含人类全基因组的基因芯片来检测MMPs及TIMPs在4例LSCC患者中共同上调或下调的基因。采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及western blot检测24例患者该基因和蛋白的表达来验证基因芯片结果,并研究该蛋白的表达与临床病理特征之间的关系。结果基因芯片显示MMPs家族在LSCC与癌旁正常细胞之间的差异表达基因有14个,其中4个基因仅表达上调,4个基因仅表达下调,另有6个基因在部分患者中表达上调,而在另一部分患者中表达下调。未发现在4例患者中共同表达上调或下调的基因。TIMPs在LSCC与癌旁正常细胞之间全部表达下调,TIMP4在4例患者中全部表达下调。RT-PCR检测结果显示TIMP4基因在LSCC组织中低表达。western blot检测结果显示TIMP4蛋白在LSCC组织中低表达,且TIMP4蛋白的表达与淋巴结转移相关。结论研究首次发现MMPs家族及TIMPs在LSCC的表达谱,并发现TIMP4蛋白的表达与LSCC临床病理特征相关。未来TIMP4蛋白可能作为LSCC潜在的治疗靶点。