华蟾素对喉癌细胞株癌基因抑制研究

目的:探讨中药华蟾素(cinobufacini,CIN)对体外培养人喉癌的喉癌细胞株(Hep-2)细胞生长作用及癌基因变化.方法:应用光镜,电镜;四甲基偶氮唑盐(MTT)检测技术;链霉素抗生物素蛋白过氧化酶连接法(SP)免疫组化技术,对药物作用后Hep-2细胞的数量,形态,癌基因P53,C-myc蛋白的表达进行研究.结果:发现华蟾素对Hep-2细胞作用在低浓度短时间时促进细胞分裂,增殖和诱导细胞分化:高浓度长时间则抑制细胞生长,促进细胞凋亡.华蟾素对Hep-2细胞癌基因影响表现为C-myc蛋白表达降低,P53蛋白表达变化不明显.结论:华蟾素对喉癌细胞的生长及癌基因有特异性作用,可作为临床喉癌综合治疗的用药之一.

靶向血管内皮生长因子的siRNA表达框架对喉癌细胞株Hep-2细胞生长的抑制作用

目的研究培养Hep-2细胞中,靶向血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的小干扰RNA表达框架(smallinterferenceRNAexpressioncassettes,SECs)对肿瘤细胞生长的影响,检测VEGF基因表达的情况,筛选最佳干扰序列,探讨RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用前景。方法根据siRNA靶序列设计原则,设计出VEGF4个位点的干扰序列,然后进行合成,即为siRNA表达框架的下游引物。由于干扰试剂盒中采用RNA介导的U6聚合酶Ⅲ启动子和改良的终止序列,从而在靶细胞内可以高水平及精确地表达siRNA。我们将4个位点的PCR产物分别转染指数生长期的Hep-2细胞,48h开始观察和检测所产生的RNA干扰的效果。结果形态学检测:转染后的1366位点的细胞可见皱缩、变圆并开始脱落,而其他三个位点的细胞形态学上未见明显的改变;逆转录-聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,与对照组相比,1366位点细胞VEGFmRNA明显被抑制,吸光度为0·05,而其他三个位点的抑制效果不显著,吸光度分别是0·25、0·30和0·18。Westernblot分析表明:与其他三个位点相比,1366位点的VEGF蛋白表达明显减弱;流式细胞仪检测表明:1366位点转染细胞的凋亡率为43%,而其他三个位点转染细胞的凋亡率改变不明显,分别为8·9%、6·5%和11·2%;本实验重复性强,同样的实验重复三次结果一致。结论研究表明靶向VEGF的1366位点的siRNA表达框架能高效抑制喉癌细胞株Hep-2细胞的生长。

美洛昔康对人喉癌Hep-2细胞株作用的研究

目的探讨美洛昔康对喉癌细胞株Hep-2凋亡作用和对体外培养喉癌Hep-2细胞周期的影响及作用机制。方法应用肿瘤细胞培养技术,随机分实验组和空白对照组,培养不同时间后,用流式细胞仪检测美洛昔康对Hep-2细胞凋亡发生率及对细胞周期的影响,同时检测美洛昔康作用Hep-2细胞后细胞线粒体跨膜电位的变化。结果流式细胞仪分析显示美洛昔康呈浓度依赖性诱导Hep-2细胞凋亡,且实验组G1期细胞数明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);实验组Hep-2细胞线粒体跨膜电位明显下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论美洛昔康具有诱导Hep-2细胞凋亡及抑制细胞分化的作用,其机制可能与触发了线粒体凋亡途径有关。

紫杉醇对喉癌细胞CK13mRNA表达的影响

目的探讨紫杉醇对喉癌细胞Hep-2生长抑制作用;紫杉醇对细胞角蛋白基因13(cytokeratin13,CK13)mRNA表达的影响。方法应用MTT法检测紫杉醇对Hep-2细胞的抑制率;采用半定量RT-PCR法检测紫杉醇作用Hep-2细胞后CK13mRNA的表达。结果紫杉醇在10-7mol/L以上浓度时,对Hep-2细胞抑制率大于30%(P<0.01);10-8mol/L以上浓度的紫杉醇可下调CK13mRNA的表达,其作用呈剂量依赖性。结论Hep-2细胞对10-7mol/L以上浓度紫杉醇具有高度敏感性;紫杉醇可能通过抑制CK13mRNA表达从而抑制肿瘤的侵袭及转移。

两种藻胆蛋白对人喉癌Hep-2细胞的光动力杀伤效果

从条斑紫菜中提取高纯度R-藻红蛋白(R-PE)和R-藻蓝蛋白(C-PC),采用MTT法测定主要研究了不同浓度(10、25、50和100μg/ml)R-PE和C-PC分别介导的光动力效应对人喉癌Hep-2细胞的生存率的影响。实验结果显示,两种藻胆蛋白的光动力作用对Hep-2细胞具有杀伤作用。在浓度为100μg/ml,照射剂量为50J/cm2的条件下,藻蓝蛋白对应的细胞存活率为64%,藻红蛋白对应的仅为57%;单用碘钨灯处理,Hep-2细胞的存活率达到86.9%;而单独使用这两种藻胆蛋白处理Hep-2细胞,培养24h后,低浓度藻胆蛋白(10、25μg/ml)对细胞的抑制效果不明显,高浓度对细胞生长具有一定的抑制效果,抑制率为68%。实验证明条斑紫菜R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白具有可开发人喉癌治疗光敏剂应用前景。

靶向血小板衍生生长因子-B siRNA对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的探讨血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)B链mRNA的siRNA质粒转染喉癌细胞株Hep-2细胞,沉默Hep-2细胞中PDGF-B mRNA并检测细胞增殖。方法以脂质体lip2 0 0 0为载体,设计4组针对PDGF-B的siRNA片段瞬时转染喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR、Westernblot分别检测各组PDGF-B mRNA、PDGF-B蛋白的表达及干扰效果,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖抑制率,并与阴性对照组和空脂质体组进行比较。结果实时荧光定量PCR检测显示:SiRNA2、SiRNA3、SiRNA4组PDGF-B mRNA表达均有明显抑制,其中SiRNA2抑制率最高;与SiRNA1、阴性对照组及空脂质体组进行比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。Westernblot检测显示:SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3组PDGF-B mRNA蛋白表达均有下降,其中SiRNA-2下降最明显,而SiRNA-4、阴性对照组及空脂质体组对PDGF-B蛋白表达无明显抑制作用。MTT法检测显示:SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3均明显抑制Hep-2细胞增殖,其中SiRNA-2对Hep-2细胞的抑制作用最明显;且与SiRNA-4、阴性对照组及空脂质体组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功运用siRNA干扰喉癌Hep-2细胞PDGF-B mR-NA,靶向沉默PDGF-B mRNA能有效抑制细胞增殖。

X射线照射Hep-2细胞对其培养基吸收光谱的影响

采用分光光度计分别测量了受不同剂量X射线照射后继续培养48h时的人上皮样喉癌细胞株Hep-2的培养基RPMI1640的紫外吸收光谱,分析了该培养基中蛋白质的紫外吸收特性。结果发现:各组培养基的吸收光谱存在明显的差别,新鲜培养基RPMI1640(10%胎牛血清)233nm处的吸收峰在细胞生长过程中位移至235nm,275nm处的吸收峰位移至278nm。反映出各组培养基中芳香族氨基酸中各种氨基酸如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量的变化,说明癌细胞在生长过程中对这几种氨基酸的改变不是按等量比的。实验还发现细胞培养基的吸收光谱强度与各剂量组细胞数基本成正相关,进而与细胞所受X射线照射的剂量有内在的联系。这些结果将为利用光谱技术研究人喉癌最佳X射线放射剂量奠定基础。

Survivin基因在喉癌中的表达及意义

目的研究Survivin基因在喉癌中的表达及其与各临床病理因素的关系。方法应用RT-PCR法检测2株喉癌细胞株,40例喉癌组织标本及相应的癌旁组织中Survivin基因的表达;应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接SP法检测Survivin基因在120例喉癌组织中的表达情况。结果RT-PCR显示喉癌细胞株和67.5%(27例)的喉癌组织表达SurvivinmRNA,而癌旁组织内无1例阳性表达。SP法显示在Survivin基因在喉癌中阳性表达率为66.7%,其阳性表达率在有无淋巴结转移、复发、临床分期、5年生存率等方面差异有显著性(P<0.05)。结论Survivin基因与喉癌的自然的发展过程有关,同时可作为判断肿瘤恶性程度,判断预后的有效指标。Survivin基因可能成为喉癌新的诊断标志及基因治疗的靶点。

氯丙嗪协同斑蝥酸钠维生素B6对Hep-2细胞的增殖抑制作用

目的探讨盐酸氯丙嗪联合斑蝥酸钠维生素B6对人喉癌Hep-2细胞株的增殖抑制作用及其对细胞周期进程的影响。方法应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测单独斑蝥酸钠维生素B6制剂及盐酸氯丙嗪联合斑蝥酸钠维生素B6制剂对Hep-2细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期进程的变化。结果单独斑蝥酸钠维生素B6组对Hep-2细胞增殖有明显的抑制作用,而斑蝥酸钠维生素B6联合氯丙嗪效果明显高于单独斑蝥酸钠维生素B6组。流式细胞仪结果显示,G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,且细胞凋亡率升高。结论斑蝥酸钠维生素B6对Hep-2细胞生长、增殖及其对细胞周期进程均有抑制作用,尤其是氯丙嗪联合斑蝥酸钠维生素B6组效果显著。

X射线照射对Hep-2细胞吸收光谱的影响

本文采用分光光度法研究了不同剂量X射线照射人上皮样喉癌细胞株(Hep-2)后对其吸收光谱的影响。旨在能为临床X射线放射治疗喉癌提供最佳剂量的参考。通过对六个剂量组与空白对照组吸收光谱的研究,发现不同剂量组的Hep-2细胞内蛋白质及核酸所受伤害与修复的程度不同,且发现癌细胞所受照射的剂量与其生长所受抑制程度、吸收光谱之间有一定的联系。为下一步用光谱技术的研究喉癌X射线放射最佳剂量的问题奠定了基础。

小干扰RNA沉默高迁移率族蛋白B1对喉癌细胞增殖、侵袭的影响

我们通过小干扰RNA （siRNA）技术下调人喉癌细胞株Hep-2高迁移率族蛋白（HMGB1）基因和蛋白表达,观察其对喉癌细胞增殖、侵袭的影响. 一、材料与方法 1．材料：RPMI 1640培养液、Trizol、反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）试剂盒、脂质体lipofectamine^TM 2000、噻唑蓝（MTT）、Matrigel胶、Transwell小室。

靶向封闭survivin诱导喉癌细胞凋亡及抑制其增殖的体外实验

目的:探讨靶向抑制survivin表达对喉癌细胞凋亡和增殖的影响。方法:构建survivin反义RNA表达载体。用脂质体转染技术将重组质粒转染人喉癌细胞株Hep-2,利用G418(300g/L的维持浓度)筛选,获得稳定转染株(HpEGFP/survivin)。用Western-blot检测survivin反义RNA封闭survivin后蛋白表达效果。吖啶橙染色和流式细胞仪、四唑盐(MTT)和软琼脂集落形成实验分别检测HpEGFP/surivin的凋亡和增殖状态的改变,并与Hep-2和转染空载体的细胞(HpEGFP-C1)进行比较。结果:Western-blot结果表明,构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制了Hep-2survivin蛋白的表达。转染反义survivinRNA载体的HpEGFP/survivin较Hep-2和HpEGFP-CI凋亡增多,其凋亡率较空载体对照组增加1.81倍,而其增殖力下降(P<0.01),软琼脂集落形成能力也明显下降(P<0.05)。结论:构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制survivin蛋白的表达,并拮抗了survivin基因的抗凋亡作用,抑制喉癌细胞体外增殖能力和生存能力。

白藜芦醇与紫杉醇联合用药对人喉癌Hep-2细胞凋亡机制的研究

喉癌是呼吸道肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,在呼吸道肿瘤中高居第二位。白藜芦醇(resveratrol,Res)是一种多酚类物质,可通过抑制细胞内核苷酸还原酶抑制肝癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞等肿瘤细胞生长。紫杉醇(taxol,Tax)是红豆杉属植物中一种次生代谢物,可抑制细胞内微管的解聚,对乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等肿瘤有良好的抗肿瘤活性。目前有关白藜芦醇联合紫杉醇用药针对人喉癌细胞株Hep-2的作用及其相关分子机制研究还鲜见报道。用白藜芦醇(Res)、紫杉醇(Tax)处理人喉癌细胞株Hep-2,采用CCK-8法检测2种药物对Hep-2细胞增殖的影响,AO/PI染色和JC-1检测Hep-2细胞凋亡,实时定量PCR检测Bax,Bcl-2,PARP,TRIB3,XIAP基因的表达,荧光定量法检测caspase-3,caspase-8活性。结果表明,与Tax,Res单独用药相比,联合组显著增强对Hep-2细胞的抑制作用,且明显减少Tax的用药剂量,增加Bax,PARP,TRIB3的表达,降低Bcl-2,XIAP的表达,促进caspase-3,caspase-8活性。这表明Res,Tax以及其联合药物通过线粒体途径诱导喉癌细胞Hep-2的细胞凋亡。这为进一步研究Res,Tax联合用药治疗喉癌奠定理论基础,且扩大Res,Tax联合用药范围。

混合酶酶解法对天龙粉水提液抗肿瘤作用影响的研究

目的:比较天龙粉水提液经混合酶酶解前后对喉癌hep2细胞株的抑制作用。方法:使用MTT法,以细胞抑制率为指标,研究天龙粉水提液经胰蛋白酶和弹性蛋白酶作用前后对喉癌hep2细胞株的抑制作用。结果:在所选药物浓度范围内,天龙粉水提液对喉癌hep2细胞株无抑制作用,一定浓度的天龙粉酶解液对喉癌hep2细胞株有抑制作用。结论:天龙粉水提液经胰蛋白酶和弹性蛋白酶酶解后在一定药物浓度下产生抑制喉癌hep2细胞株生长的作用。

葡萄籽原花青素联合顺铂对喉癌细胞Hep-2生物学作用及机制研究

目的利用葡萄籽原花青素及其联合顺铂在体外作用于喉癌细胞Hep-2,观察其对喉癌细胞增殖、凋亡的影响,并探讨抗肿瘤作用的可能机制。方法 MTT法检测各组药物对喉癌细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期;TUNEL法检测各组药物对喉癌细胞凋亡率的影响;采用流式细胞仪分析凋亡细胞比例,Western blot法检测各组药物对喉癌细胞Bax/Bcl-2表达情况的影响。结果 MTT和TUNEL结果显示,GSPE+顺铂组的喉癌细胞抑制增殖作用明显高于单纯GSPE组和单纯顺铂组,差异均有统计学意义(P<0.05);细胞周期结果显示,GSPE+顺铂组处于S+G2M期的细胞数明显低于单纯GSPE和单纯顺铂组,差异均有统计学意义(P<0.05);蛋白表达结果显示,GSPE+顺铂组的Bax/Bcl-2的表达明显高于单纯GSPE组和单纯顺铂组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论葡萄籽原花青素可诱导喉癌Hep-2细胞凋亡;与单纯应用葡萄籽原花青素或顺铂比较,葡萄籽原花青素联合顺铂可以起到更好的增殖抑制并诱导喉癌细胞凋亡,两者具有协同作用。