甘草甜素对喉癌Hep-2细胞侵袭和迁移的影响及机制研究

目的:探究甘草甜素(Gly)对喉癌Hep-2细胞侵袭和迁移的影响及作用机制。方法:体外培养正常人喉黏膜上皮细胞和喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和蛋白印迹实验检测微小RNA-205-5p(miR-205-5p)、沉默信息调节因子2相关酶3(SIRT3)mRNA和蛋白表达水平。将喉癌Hep-2细胞分为对照组、Gly低浓度组、Gly中浓度组、Gly高浓度组、Gly高浓度+空载质粒组、Gly高浓度+miR-205-5p抑制剂组。各组给予相应浓度的Gly干预或转染对应质粒培养48 h。Transwell实验和划痕实验分别检测各组Hep-2细胞侵袭和迁移能力。RT-qPCR法和蛋白印迹实验检测各组Hep-2细胞miR-205-5p、SIRT3 mRNA和蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验分析miR-205-5p与SIRT3的靶向关系。结果:与人喉黏膜上皮细胞比较,喉癌Hep-2细胞miR-205-5p水平降低,SIRT3 mRNA和蛋白水平升高(均P<0.05)。与对照组比较,Gly低、中、高浓度组穿膜细胞数和划痕愈合率、SIRT3 mRNA和蛋白水平依次降低,miR-205-5p水平依次升高(均P<0.05)。与Gly高浓度组和Gly高浓度+空载质粒组比较,Gly高浓度+miR-205-5p抑制剂组穿膜细胞数和划痕愈合率、SIRT3 mRNA和蛋白水平升高,miR-205-5p水平降低(均P<0.05)。miR-205-5p可靶向调控SIRT3表达。结论:Gly能够抑制Hep-2细胞侵袭和迁移,其机制可能与上调miR-205-5p表达,进而靶向下调SIRT3表达有关。

抗肿瘤药物与TRAIL联用对喉癌HEP-2细胞株增殖、凋亡的影响

目的探讨化疗药物顺铂(DDP)、5氟尿嘧啶(5-Fu)单独及与TRAIL联合对HEP-2细胞株增殖、凋亡的影响。方法MTT法检测其增殖抑制作用,FCM法检测细胞凋亡率。结果TRAIL与5-Fu、DDP联合作用于HEP-2细胞株时,其抑制率、凋亡率高于单独作用时的抑制率和凋亡率。结论TRAIL与5-Fu、DDP联合作用有协同抑制HEP-2细胞株增殖、诱导HEP-2细胞株凋亡的作用。

靶向血管内皮生长因子的siRNA表达框架对喉癌细胞株Hep-2细胞生长的抑制作用

目的研究培养Hep-2细胞中,靶向血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的小干扰RNA表达框架(smallinterferenceRNAexpressioncassettes,SECs)对肿瘤细胞生长的影响,检测VEGF基因表达的情况,筛选最佳干扰序列,探讨RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用前景。方法根据siRNA靶序列设计原则,设计出VEGF4个位点的干扰序列,然后进行合成,即为siRNA表达框架的下游引物。由于干扰试剂盒中采用RNA介导的U6聚合酶Ⅲ启动子和改良的终止序列,从而在靶细胞内可以高水平及精确地表达siRNA。我们将4个位点的PCR产物分别转染指数生长期的Hep-2细胞,48h开始观察和检测所产生的RNA干扰的效果。结果形态学检测:转染后的1366位点的细胞可见皱缩、变圆并开始脱落,而其他三个位点的细胞形态学上未见明显的改变;逆转录-聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,与对照组相比,1366位点细胞VEGFmRNA明显被抑制,吸光度为0·05,而其他三个位点的抑制效果不显著,吸光度分别是0·25、0·30和0·18。Westernblot分析表明:与其他三个位点相比,1366位点的VEGF蛋白表达明显减弱;流式细胞仪检测表明:1366位点转染细胞的凋亡率为43%,而其他三个位点转染细胞的凋亡率改变不明显,分别为8·9%、6·5%和11·2%;本实验重复性强,同样的实验重复三次结果一致。结论研究表明靶向VEGF的1366位点的siRNA表达框架能高效抑制喉癌细胞株Hep-2细胞的生长。

粉防己碱对喉癌耐药细胞株Hep-2／ADM多药耐药逆转作用研究

目的探讨天然有效成分粉防己碱(tetrandrine,TET)对喉癌耐药细胞株Hep-2/ADM的多药耐药逆转作用及其可能机制。方法采用MTT法检测不同浓度粉防己碱对Hep-2/ADM细胞的增殖抑制效应,选取其无毒剂量;MTT法检测长春新碱(vincristine,VCR)对HEP-2和Hep-2/ADM细胞增殖的抑制作用及加用粉防己碱后的变化;采用流式细胞仪检测细胞内药物蓄积和外排程度以及细胞凋亡。结果1.5μg/ml及更低浓度的粉防己碱对Hep-2/ADM细胞无明显细胞毒性作用。加入1.0μg/ml和1.5μg/ml粉防己碱后,Hep-2/ADM对VCR的耐药逆转倍数分别为1.72和2倍。1.5μg/ml浓度的粉防己碱可提高VCR在Hep-2/ADM细胞内药物的蓄积,增强VCR诱导的Hep-2/ADM细胞凋亡。结论粉防己碱可以部分逆转Hep-2/ADM细胞的多药耐药,随药物浓度增加,逆转效果有可能增强,其逆转机制可能与抑制P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)外排功能和增强化疗药物诱导的细胞凋亡有关。

抑制自噬可以增加mTOR抑制剂AZD8055引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡

目的探讨抑制自噬是否可以增加哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)抑制剂(AZD8055)引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡。方法选用人喉癌细胞株Hep-2细胞系,应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测m TOR抑制剂AZD8055和(或)自噬抑制剂3-甲基嘌呤(3-MA)对Hep-2细胞活性的影响。Western印迹检测AZD8055和(或)3-MA对Hep-2细胞凋亡通路相关蛋白〔Cleaved多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、Cleaved Caspase-3、细胞色素C〕的作用。结果 AZD8055作用Hep-2细胞24 h后,细胞生存率显著下降,具有浓度依赖性。AZD8055浓度依赖性地增加Hep-2细胞凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3及细胞色素C表达。当3-MA与AZD8055联用时,二者联用与单用AZD8055组相比,细胞活性显著降低,显著下调凋亡通路相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、细胞色素C表达。结论抑制自噬可以增加m TOR抑制剂AZD8055引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡。

抗人喉癌/抗CD_3双功能抗体的制备及对Hep-2细胞株的杀伤作用

目的 :研究制备抗人喉癌 抗CD3 双功能抗体 ,探讨喉癌主动免疫治疗。方法 :以化学方法将人喉癌及抗CD3单克隆抗体交联为双功能抗体 ,进行介导对肿瘤细胞的杀伤作用。结果 :该双功能抗体介导效应细胞对靶细胞的杀伤率高于抗CD3 的介导作用 ,并随着效靶比的提高而升高。结论 :采用化学交联法制备的抗人喉癌 CD3 双功能抗体具有潜在的临床应用价值。

美洛昔康对人喉癌Hep-2细胞株作用的研究

目的探讨美洛昔康对喉癌细胞株Hep-2凋亡作用和对体外培养喉癌Hep-2细胞周期的影响及作用机制。方法应用肿瘤细胞培养技术,随机分实验组和空白对照组,培养不同时间后,用流式细胞仪检测美洛昔康对Hep-2细胞凋亡发生率及对细胞周期的影响,同时检测美洛昔康作用Hep-2细胞后细胞线粒体跨膜电位的变化。结果流式细胞仪分析显示美洛昔康呈浓度依赖性诱导Hep-2细胞凋亡,且实验组G1期细胞数明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);实验组Hep-2细胞线粒体跨膜电位明显下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论美洛昔康具有诱导Hep-2细胞凋亡及抑制细胞分化的作用,其机制可能与触发了线粒体凋亡途径有关。

TRAIL联合化疗药物诱导喉癌HEP-2细胞株凋亡的研究

目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducingligand,TRAIL)与化疗药物氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)联合使用诱导喉癌HEP-2细胞株凋亡。方法:不同浓度的TRAIL、5-FU、DDP单独及TRAIL与5-FU、DDP联合处理HEP-2细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测其细胞毒作用,荧光显微镜下观察并计算凋亡率,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率。结果:HEP-2细胞对低毒性的TRAIL不敏感,对化疗药物相对敏感,TRAIL与低毒性的化疗药物联合作用于细胞后可增强杀伤效应。结论:TRAIL与低毒性的5-Fu、DDP联用表现出高效的杀灭肿瘤细胞作用。

喉癌细胞株 HEp-2 性激素代谢的研究

人喉癌细胞株ＨＥｐ－２经无性激素培养基（活性碳处理小牛血清）培养后，收集细胞制备匀浆，用３Ｈ标记配体测定其雄激素受体、雌激素受体，同时测定５α－还原酶（５α－Ｒ）和１７β－羟类固醇脱氢酶（１７β－ＨＳＤ）活性。结果显示，ＨＥｐ－２细胞株含雄激素受体，受体水平为１３．７３ｆｍｏｌ·Ｌ－１·ｍｇ－１Ｐｒ，未测到雌激素受体；５α－Ｒ催化睾酮还原为二氢睾酮的转换率为５０％，１７β－ＨＳＤ活性极低。提示ＨＥｐ－２喉癌细胞株仍保留表达雄激素受体的能力，而且５α－Ｒ的活性较高。

靶向血小板衍生生长因子-B siRNA对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的探讨血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)B链mRNA的siRNA质粒转染喉癌细胞株Hep-2细胞,沉默Hep-2细胞中PDGF-B mRNA并检测细胞增殖。方法以脂质体lip2 0 0 0为载体,设计4组针对PDGF-B的siRNA片段瞬时转染喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR、Westernblot分别检测各组PDGF-B mRNA、PDGF-B蛋白的表达及干扰效果,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖抑制率,并与阴性对照组和空脂质体组进行比较。结果实时荧光定量PCR检测显示:SiRNA2、SiRNA3、SiRNA4组PDGF-B mRNA表达均有明显抑制,其中SiRNA2抑制率最高;与SiRNA1、阴性对照组及空脂质体组进行比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。Westernblot检测显示:SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3组PDGF-B mRNA蛋白表达均有下降,其中SiRNA-2下降最明显,而SiRNA-4、阴性对照组及空脂质体组对PDGF-B蛋白表达无明显抑制作用。MTT法检测显示:SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3均明显抑制Hep-2细胞增殖,其中SiRNA-2对Hep-2细胞的抑制作用最明显;且与SiRNA-4、阴性对照组及空脂质体组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功运用siRNA干扰喉癌Hep-2细胞PDGF-B mR-NA,靶向沉默PDGF-B mRNA能有效抑制细胞增殖。

miR-137对人喉癌细胞株Hep-2细胞增殖的影响

目的研究miR-137对喉癌细胞株Hep-2细胞增殖及细胞周期的影响。方法将Hep-2细胞分为转染miR-137寡聚核苷酸组(A组)、转染无义序列组(B组)和空白对照组(C组)。采用RT-PCR、MTT法、流式细胞仪和Western blot技术评价各组细胞增殖和细胞周期的生物学特征。结果转染miR-137寡聚核苷酸后,Hep-2细胞中miR-137表达显著增加。与C组相比,A组细胞增殖水平明显抑制,miR-137寡聚核苷酸能够有效诱导Hep-2细胞周期阻滞在G1/G0期;A组细胞分裂周期蛋白42表达水平明显下调,细胞周期调控因子蛋白CDK4及细胞周期素D1蛋白表达水平明显降低。结论 miR-137寡聚核苷酸能够显著抑制喉癌细胞Hep-2的增殖,miR-137是潜在的人喉癌细胞基因治疗的候选靶点。

miR-135a通过下调SOX2抑制喉癌Hep-2细胞的恶性生物学行为和增强对奥沙利铂的敏感性

目的:探讨敲降miR-135a对人喉癌上皮Hep-2细胞的恶性生物学行为和奥沙利铂敏感性的影响。方法:收集2018年1月至2018年6月郑州大学附属南阳医院南阳市中心医院行喉癌切除术10例患者的喉癌组织和癌旁组织标本。采用qPCR检测喉癌组织和Hep-2细胞中miR-135a的表达水平。miR-135 inhibitor转染喉癌Hep-2细胞后,采用CCK-8检测Hep-2细胞活性,集落形成实验检测Hep-2细胞集落形成能力,Transwell实验检测Hep-2细胞的侵袭及迁移能力,WB实验检测Hep-2细胞中SOX2蛋白的表达水平。0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L的奥沙利铂处理已转染miR-135 inhibitor的Hep-2细胞,CCK-8实验检测Hep-2细胞的增殖活性,Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术检测Hep-2细胞的凋亡率。采用miR-135a inhibitor质粒、对照pcDNA空载体(SOX2-Con)质粒、pcDNA-SOX2(SOX2-OE)质粒共转染Hep-2细胞,构建miR-135a inhibitor+SOX2-Con组和miR-135a inhibitor+SOX2-OE组,检测此2组细胞的增殖活性、集落形成能力、侵袭及迁移能力。结果:与癌旁组织比较,喉癌组织中miR-135a表达水平显著升高(P<0.01);与正常NHP细胞比较,miR-135a在Hep-2细胞中表达水平明显上调(P<0.01);转染miR-135a inhibitor导致Hep-2细胞中miR-135a表达水平明显降低(P<0.01)。敲降miR-135a明显降低Hep-2细胞的增殖活性、细胞集落数、迁移、侵袭和SOX2表达(均P<0.01);明显增强细胞对奥沙利铂敏感性(P<0.01);与miR-135a inhibitor+SOX2-Con组比较,miR-135a inhibitor+SOX2-OE组的Hep-2细胞的增殖活性、细胞集落数、迁移与侵袭能力均明显增加(均P<0.01);同时,用不同浓度的奥沙利铂处理此2组细胞,相对于miR-135a inhibitor+SOX2-Con组,miR-135a inhibitor+SOX2-OE组的Hep-2细胞存活率显著升高(P<0.01)。结论:敲降miR-135a可能通过下调转录因子SOX2的表达抑制Hep-2细胞的恶性生物学行为,并增强其对奥沙利铂的敏感性。

藻蓝蛋白诱导喉癌HEP-2细胞凋亡的实验研究

目的:探讨藻蓝蛋白对人喉癌HEP-2细胞凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法:不同浓度藻蓝蛋白处理HEP-2细胞,分别以MTT、倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜、流式细胞术检测藻蓝蛋白对HEP-2细胞活力及凋亡的影响;DCFH-DA标记的流式细胞术检测细胞内的活性氧水平;分光光度法检测细胞内caspase-3、-8、-9的活性;RT-PCR、Western blot检测细胞凋亡相关基因的表达。结果:MTT结果显示藻蓝蛋白能够抑制喉癌HEP-2的细胞活力,且呈时间和剂量依赖性;倒置显微镜、电镜、流式细胞术的一系列定性化和定量化实验证实藻蓝蛋白可显著诱导HEP-2细胞的凋亡;藻蓝蛋白处理后细胞内ROS水平升高,caspase-3、-8、-9被激活;RT-PCR结果表明,藻蓝蛋白作用后Bax、Fas、P53、caspase-3和caspase-9表达显著上调(P<0.05),Bcl-2表达显著下调(P<0.05);Western blot结果和RT-PCR结果一致。结论:藻蓝蛋白能够诱导HEP-2细胞的凋亡,其机制可能与细胞内ROS水平升高,上调Bax、Fas和P53 mRNA,下调Bcl-2 mRNA的表达,从而促进凋亡信号的转导最终导致细胞凋亡有关。

槲皮素对喉癌细胞Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用

目的研究槲皮素在体外对喉癌Hep-2细胞株的生长和凋亡的影响。方法应用MTT法、电镜和流式细胞术等方法对在体外经不同浓度槲皮素处理过的Hep-2细胞进行检测,观察细胞增殖和凋亡的改变。结果①槲皮素在一定浓度范围内能明显抑制Hep-2细胞的生长,作用72 h的半数抑制浓度(IC50)是52.48μmol/L,呈剂量依赖性关系。②PB能诱导Hep-2细胞凋亡,发生G1→S期阻滞。结论槲皮素可使喉癌Hep-2细胞增殖抑制和凋亡,为槲皮素用于喉癌临床治疗提供了部分依据。

松乳菇多糖对人喉癌Hep-2细胞肿瘤相关基因转录的影响

运用基因芯片技术分析松乳菇多糖对人喉癌Hep-2细胞肿瘤相关基因表达的影响及分子机制。结果表明,经松乳菇多糖600μg/m L处理48 h后,在人喉癌Hep-2细胞中发现相关肿瘤差异基因共68个,其中人喉癌Hep-2细胞肿瘤相关基因下调倍数大于100倍的基因共8个,下调50~100倍的基因共14个,同时按基因转录水平将这些基因进行了分类。运用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析技术分析相关基因通路,结果显示松乳菇多糖主要抑制人喉癌Hep-2细胞中的MAPK信号转导通路和PI3K-AKT信号转导通路。在松乳菇多糖的刺激作用下,人喉癌Hep-2细胞的凋亡是多种基因共同作用的综合结果。用筛选出的基因进一步研究肿瘤凋亡的分子机制,对寻找潜在的抗肿瘤作用靶点具有重要生物学意义。

金纳米花介导的近红外热疗对人喉癌Hep-2细胞增殖的抑制作用

各向异性的金纳米粒子由于其表面等离子共振吸收峰可红移至近红外光区而具有特殊的近红外光热转换性能[1].研究结果表明,纳米棒等各向异性金纳米粒子可将入射的近红外光能转换成热能,从而有效杀伤肿瘤细胞[2].与手术、放化疗等常规治疗相比,金纳米粒子介导的近红外（NIR）热疗具有非侵入及无耐药性等优点,在肿瘤热疗和载药等领域具有广泛应用前景[3,4].传统的各向异性金纳米粒子的制备过程中需引入对生物体有毒的表面活性剂作配体[5,6],限制了其在生物医学领域的应用.

TNF-α和IFN-γ对Hep-2喉癌细胞MMPs表达的调节作用

目的 :研究喉癌 Hep- 2细胞系中 MMP- 2、MMP- 9、TIMP- 1、TIMP- 2和 MT1 - MMP的表达及 TNF- α和 IFN- γ对 MMPs表达的调节作用。方法 :分别在细胞生长的不同时期收集细胞 ,采用半定量 RT- PCR方法 ,分析 Hep- 2细胞 MMP- 2、MMP- 9、MT1 - MMP和 TIMP- 1、TIMP- 2 m R-NA的表达水平。结果 :细胞接种后 2 4 h MMP- 2和 MMP- 9的 m RNA水平最高。Hep- 2细胞在第2、3天 MT1 - MMP m RNA的表达水平最高 ,细胞表达相对恒定的 TIMP- 1而细胞内 TIMP- 2 m R-NA的表达水平比 TIMP- 1高 2倍。 TNF-α可增强 Hep- 2细胞的 MMP- 2 m RNA的表达 ,IFN-γ可抑制 MMP- 2的表达。两种因子联合应用时其作用可相互抵消。 MT- MMP和 TIMP- 1对 TNF-α和 IFN- γ的调节不敏感。 TIMP- 2 m RNA的水平可被 TNF- α抑制 1倍 ,而 IFN- γ能够增强TIMP- 2 m RNA的水平。结论 :细胞因子对 MMPs的转录有调节作用 ,IFN- γ能够降低 MMP- 2、MMP- 9的表达 ,可成为一种很有价值的喉癌辅助治疗药物。

中药HB对喉癌Hep-2细胞的抑制作用及其机制研究

目的 研究蜈蚣提取物HB对喉癌Hep 2细胞生长的抑制作用及其作用机制。方法 MTT法观察不同浓度的HB对Hep 2细胞的生长抑制情况 ;采用激光扫描共聚焦技术分析HB作用Hep 2细胞 48h后细胞内钙、DNA含量的变化情况。结果 Hep 2细胞用 10 μg/ml、10 0 μg/ml的HB处理 72h后 ,细胞存活率显著降低 ;用 10 μg/ml和2 0 μg/ml的HB处理Hep 2细胞 48h后 ,细胞内钙含量显著升高 (P <0 .0 0 1) ,DNA含量显著降低 (P <0 .0 0 1)。 结论 中药HB在体外对Hep 2细胞的生长有明显地抑制作用 ,机制与降低细胞内DNA含量 。

紫草素对人喉癌Hep-2细胞生长的作用研究

目的:研究紫草素对人喉癌Hep-2细胞生长的作用。方法:以不同浓度的紫草素作用于人喉癌Hep-2细胞,MTT法检测紫草素对人喉癌Hep-2细胞生长的抑制率,荧光显微镜观察人喉癌Hep-2细胞凋亡情况,流式细胞仪分析细胞周期分布及凋亡率变化,荧光定量PCR法测量人喉癌Hep-2细胞增殖诱导配体(APRIL)的表达量。结果:紫草素对人喉癌Hep-2细胞的增殖有明显抑制作用,并呈明显的量效关系和时间依赖性。紫草素主要阻滞细胞G1期向S期的发展。紫草素作用人喉癌Hep-2细胞后其APRIL mRNA表达量随时间的延长和浓度的增加而升高,48 h后各紫草素浓度组APRIL mRNA表达与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:紫草素可以抑制喉癌Hep-2细胞的增殖,未凋亡的人喉癌Hep-2细胞因APRIL表达升高而有增殖能力增强的潜在趋势。

天然植物银杏酸诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的初步研究

目的研究天然植物银杏酸对喉癌Hep-2细胞生长的抑制作用,并探讨其作用机理。方法采用四唑盐比色实验(MTT)、DNA电泳、流式细胞仪分析等方法观察不同浓度和不同作用时间银杏酸对喉癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响。结果银杏酸对喉癌Hep-2细胞呈现时间和剂量依赖性的生长抑制作用;DNA经琼脂糖电泳可见典型的梯形条带;流式细胞仪分析显示银杏酸作用后,细胞凋亡率呈时间和剂量依赖性增加。结论银杏酸可抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡,具有明显的体外抗肿瘤活性。