survivin基因在化疗药物诱导的喉鳞癌Hep-2细胞凋亡中的作用

目的:探讨survivin基因在化疗药物三氧化二砷(As2O3)和顺铂(DDP)诱导的喉鳞癌(Hep-2)细胞凋亡中的作用。方法:用Hep-2细胞株进行培养传代,以不同浓度的As2O3和DDP作用于Hep-2细胞,MTT观察As2O3和DPP对Hep-2细胞生长的抑制情况,TUNEL法检测细胞凋亡数量,用RT-PCR方法检测survivin基因的表达。结果:As2O3和DDP对Hep-2细胞的生长均有抑制作用,具有时间-剂量依赖性,化疗药物组细胞凋亡率和survivin基因表达抑制率高于对照组。结论:在As2O3和DPP诱导的Hep-2细胞凋亡中survivin基因表达被抑制,survivin基因可能在DPP和As2O3抗肿瘤中发挥重要作用。

蜂胶诱导喉鳞癌Hep-2细胞凋亡及机制探讨

采用体外细胞培养实验方法,应用四甲基偶氮唑蓝法、流式细胞仪检测、共聚焦显微镜技术,观察蜂胶对喉鳞癌Hep-2细胞的抑制率、凋亡率的影响及细胞内Ca2+变化。细胞抑制率随用药时间的延长、剂量增加而增大。蜂胶能诱导喉鳞癌细胞凋亡,非特异性地阻滞Hep-2细胞周期的全过程。细胞内Ca2+随药物浓度的增加而升高(P<0.05)。认为蜂胶有诱导Hep-2细胞凋亡的作用,其机制可能与细胞内Ca2+变化有关。

低氧对人喉鳞癌Hep-2细胞凋亡的影响及其机制探讨

目的观察低氧对人喉鳞癌Hep-2细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法将体外培养的人喉鳞癌细胞分为常氧组、低氧组。流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR及Western blot法分别检测各组细胞低氧诱导因子α(HIF-1α)、赖氨酰氧化酶(LOX)mRNA及蛋白。结果常氧组细胞凋亡率13.86%±0.12%、低氧组5.13%±0.67%,P<0.05。与常氧组比较,低氧组细胞中HIF-1α、LOX蛋白及其mRNA表达增加(P均<0.05),且二者表达呈正相关(r均为0.862,P均<0.05)。结论低氧可抑制Hep-2细胞凋亡,该作用可能与其上调细胞中HIF-1α、LOX表达有关。

RNAi沉默喉鳞癌Hep-2细胞株VEGF-C mRNA基因表达的实验研究

目的构建针对喉鳞癌细胞株Hep-2中血管内皮生长因子C(vascular endothelial growthfactor C,VEGF-C)的siRNA表达载体,研究载体介导的RNAi技术对喉鳞癌细胞株Hep-2中VEGF-C mRNA表达的抑制作用。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以VEGF-C为靶基因,同时随机组合出一条对照序列,分别合成2对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成互补DNA双链,克隆入siRNA表达载体pSuper-neo中,转化鉴定后进行PCR和DNA序列测定。用脂质体介导转染入喉鳞癌Hep-2细胞株,采用RT-PCR方法检测细胞VEGF-C基因mRNA水平的变化。结果成功构建发卡样VEGF-C siRNA真核表达载体;转染VEGF-C靶向siRNA(pSuper-neo-siV1)的Hep-2细胞,VEGF-C基因的表达水平较无关对照组pSuper-neo-siV2和转染空载体pSuper-neo的对照组显著下降。结论成功构建载体介导的VEGF-C靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制Hep-2细胞中VEGF-C mRNA表达。

人喉鳞癌Hep-2细胞血红素加氧酶1表达及其对卡铂作用的影响

目的探讨人喉鳞癌Hep-2细胞血红素加氧酶1(HO-1)表达对卡铂作用的影响及其可能的作用机制。方法将对数生长期Hep-2细胞分为六组。空白对照组不干预,Zn PP(HO-1抑制剂锌原卟啉)组加入Zn PP 10μmol/L;Hemin(HO-1诱导剂氯化血红素)组加入Hemin 10μmol/L;卡铂组加入卡铂10μg/m L;Hemin联合卡铂组先加入Hemin 10μmol/L,作用1 h后再加入卡铂10μg/m L;Zn PP联合卡铂组先加入Zn PP 10μmol/L,作用1 h后再加入卡铂10μg/m L。每组设5个复孔,加药后培养24 h。采用MTT法观察各组细胞存活率;RT-PCR、Western blotting法检测各组细胞内HO-1 mRNA和蛋白表达情况;DCFH-DA探针检测各组细胞内活性氧(ROS);流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果 1细胞存活率:与空白对照组比较,卡铂组和Zn PP组明显降低,Hemin组明显升高(P均<0.05);与卡铂组比较,Zn PP联合卡铂组明显降低,Hemin联合卡铂组明显升高(P均<0.05)。2细胞HO-1 mRNA和蛋白相对表达量:与空白对照组比较,卡铂组和Hemin组明显升高,Zn PP组明显下降(P均<0.05);与卡铂组比较,Zn PP联合卡铂组明显降低,Hemin联合卡铂组明显升高(P均<0.05)。3细胞凋亡率:与空白对照组比较,卡铂组、Zn PP组明显升高(P均<0.05);与卡铂组比较,Zn PP联合卡铂组明显升高,Hemin联合卡铂组明显降低(P均<0.05);4细胞内ROS活性:与空白对照组比较,卡铂组、Zn PP组显著增高(P均<0.05);与卡铂组比较,Zn PP联合卡铂组明显升高,Hemin联合卡铂组明显降低(P均<0.05)。结论 HO-1在Hep-2细胞内的高表达可影响卡铂对Hep-2细胞的促凋亡作用,应用Zn PP后HO-1表达下调,同时提高了人喉鳞癌Hep-2细胞在卡铂作用下的凋亡率,这一过程可能与增强细胞内ROS水平相关。

MiR-155对喉鳞癌细胞株Hep-2细胞增殖与侵袭能力的影响

目的探讨miR-155对喉鳞癌Hep-2细胞增殖与侵袭的影响。方法应用LipofectamineTM2000将miR-155 inhibitor和miR-155阴性对照(NC)转入Hep-2细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,Hoechst染色检测细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测信号传导与转录激活因子3(STAT3)和细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)的表达水平。结果与miR-155 NC组比较,miR-155 inhibitor能显著抑制肿瘤细胞增殖能力,提高肿瘤细胞凋亡率,降低细胞侵袭能力,并上调SOCS1,下调STAT3表达水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-155可能通过SOCS1/STAT3信号通路促进Hep-2细胞增殖,抑制凋亡,并能提高细胞的侵袭能力,进而发挥致癌作用。

三氧化二砷对人喉鳞癌细胞株Hep-2增殖抑制和细胞凋亡作用的体外研究

目的观察三氧化二砷(Arsenic trioxide,As_2O_3)对人喉鳞癌细胞株Hep-2细胞的作用,为晚期喉癌的综合治疗提供实验依据。方法以不同浓度的As_2O_3作用于Hep-2,利用细胞生长曲线、MTF法、瑞氏-吉姆萨(Wrighs-Gimesa)染色,DNA凝胶电泳技术,TUNEL,流式细胞术,观察其细胞增殖抑制、凋亡及细胞周期作用。结果 As_2O_3对Hep-2具有增殖抑制作用,显示时间和剂量效应。在一定剂量和时间范围内,主要引起细胞凋亡,并具有药物浓度依赖性,细胞大部分阻滞在G_2+M期。结论 As_2O_3对Hep-2具有增殖抑制及诱导调亡的双重作用,为喉癌治疗提供了一个具有可行性的设想和依据。

MicroRNA-25在喉鳞癌细胞侵袭转移中的作用探讨

背景导致喉癌患者死亡的主要原因是复发和转移,喉癌侵袭转移的分子机制已成为当前研究的重点。目的研究microRNA-25(miR-25)在喉鳞癌Hep-2细胞体外侵袭转移中的调控作用。方法应用微小RNA过表达载体(mimic)和抑制载体(inhibitor)转染Hep-2细胞,分别增加和抑制Hep-2细胞中miR-25的表达,Transwell法和细胞划痕实验检测Hep-2细胞侵袭迁移能力的变化,MTT法检测细胞增殖能力变化,绘制细胞生长曲线。结果上调Hep-2细胞中miR-25表达后,Transwell实验和细胞划痕实验显示Hep-2细胞的体外侵袭和迁移能力显著低于正常对照组(P<0.01),MTT检测结果显示过表达miR-25组Hep-2细胞增殖能力亦显著降低。而抑制miR-25表达后,Hep-2细胞体外侵袭、迁移和增殖能力均显著增强。结论miR-25的表达量显著影响喉鳞癌Hep-2细胞体外侵袭、迁移和增殖能力,提示miR-25可能是抑制喉鳞癌转移的一个有效靶点。

沉默A20基因对人喉鳞癌细胞系Hep-2增殖、周期、侵袭能力的影响

目的观察沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(A20)基因对人喉鳞癌细胞系Hep-2增殖、周期、侵袭能力的影响。方法取对数生长期Hep-2细胞,接种至6孔板,待细胞融合达80%~90%时进行分组,实验共分为A20siRNA组、NC siRNA组、对照组,A20 siRNA组、NC siRNA组应用Lipofectamine RNAi MAX转染试剂分别转染A20siRNA、NC siRNA,转染操作严格按照试剂盒说明书操作,对照组不做任何处理。转染后48 h,采用qRT-PCR法和Western blotting法分别检测A20 mRNA、蛋白,CCK8实验、平板克隆实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell小室测定细胞侵袭能力。结果与NC siRNA组及对照组比较,A20 siRNA组A20 mRNA、蛋白表达降低,24、48、72 h的OD值降低,细胞G0/G1期比例升高,细胞S期、G2/M期比例降低,穿膜细胞数降低(P均<0. 05)。结论沉默A20基因能够抑制Hep-2细胞增殖和侵袭,缩短细胞周期。

超抗原活化淋巴细胞对喉癌Hep-2细胞系的抑制作用

目的观察超抗原活化淋巴细胞后对喉癌细胞的抑制作用。方法金黄色葡萄球菌肠毒素A与人淋巴细胞混合培养24h,激活淋巴细胞,再加入人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞混合培养72h,通过MTT法观察喉癌细胞的抑制情况。结果①实验组金黄色葡萄球菌肠毒素A激活淋巴细胞后对人喉鳞癌Hep-2细胞的生长有明显的抑制作用,抑制率是42.68%,高于对照组4.82%(P<0.01)。②抑制作用呈现时间的依赖性。③金黄色葡萄球菌肠毒素A在不同浓度时对喉癌细胞的生长均有抑制作用,特别在浓度是1μg/ml、72h培养时抑制率最高,达82.83%。结论超抗原活化淋巴细胞后明显抑制喉癌细胞的生长。

OPN在喉癌组织中的表达变化及LV-shOPN对喉癌Hep-2细胞侵袭转移的影响

目的观察人喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中骨桥蛋白(OPN)的表达变化及慢病毒shOPN对喉癌Hep-2细胞侵袭转移的影响。方法采用免疫组化SP法,检测44例LSCC及癌旁正常组织中的OPN。干扰OPN慢病毒载体(LV-shOPN)转染Hep-2细胞,Western blot检测该细胞其中的OPN,MTT法检测Hep-2细胞增殖活性,Transwell小室实验检测Hep-2细胞的侵袭力。结果 LSCC组织和癌旁正常组织中OPN阳性表达率分别为75.0%(33/44)、13.6%(6/44),两者相比,P<0.01;OPN的表达与LSCC颈部淋巴结转移、临床分期、病理组织学分级有关(P均<0.01)。LV-shOPN转染后Hep-2细胞中OPN蛋白表达下降、细胞增殖活性及侵袭力降低(P均<0.05)。结论 OPN在喉癌组织中的表达高于癌旁正常组织,可能参与了喉癌的发生、发展和转移;LV-shOPN能够有效抑制Hep-2细胞的生长和侵袭转移。

Kai1/CD82对人喉癌Hep-2细胞株增殖能力的影响

目的探讨肿瘤转移抑制基因Kai1/CD82对人喉癌Hep-2细胞株增殖能力的影响。方法以喉癌Hep-2细胞株为研究对象,将携带有Kai1基因的重组腺病毒(rAd-Kai1)进行扩增、纯化并测定其滴度,用适量rAd-Kai1转染人喉癌Hep-2细胞株,以转染空病毒载体及未转染Kai1的喉癌细胞株为对照,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定Kai1对细胞增殖能力的影响,用RT-PCR技术对转染后的细胞进行检测。结果rAd-Kai1经扩增、纯化后,滴度可达6×1010PFU/ml,当病毒量为30 MOI时,Hep-2细胞的转染率可达90%以上。MTT实验显示转染空腺病毒组与未转染组比较,Hep-2细胞株体外增殖能力无统计学差异,转染Kai1组Hep-2细胞株体外增殖能力明显弱于未转染组(P<0.05),抑制率可达29%。结论肿瘤转移抑制基因Kai1/CD82对喉癌细胞株体外增殖能力具有抑制作用。

熊果酸对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:研究熊果酸(Ursolic Acid,UA)对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法:体外培养并取对数生长期的人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞分为空白对照组、UA(12.5、25、50μmol/L)组和顺铂(6μmol/L)组,每组设10个复孔。药物干预24h后,采用MTT比色法测定增值抑制率,通过流式细胞术检测细胞周期、观察细胞凋亡状况并计算凋亡率,逆转录-PCR(RT-PCR)法检测bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达并计算Bax/bcl-2表达比值,Western blotting法检测caspase-3蛋白表达。结果:UA(25、50μg/m L)组和顺铂组Hep-2细胞增殖抑制率较空白对照组显著升高,G_0/G_1期显著增长、G_2/M期显著缩短,细胞凋亡率显著升高,细胞中bcl-2 mRNA表达显著下调且Bax mRNA显著上调、Bax/bcl-2表达比值显著升高,caspase-3蛋白表达显著上调,上述差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:UA具有抑制人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖并促进其凋亡的作用,其机制可能与UA能够改变细胞周期以及调节凋亡相关基因和蛋白表达有关。

熊果酸抑制人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖的功能和机制研究

目的研究熊果酸(UA)对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖的抑制作用,并探讨其作用机制。方法分别以不同浓度UA(12.5、25、50μmol·L^(-1))和顺铂(6μmol·L^(-1))处理对数生长期人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,药物干预24 h后,采用Hoechst染色法观察Hep-2细胞生长状况,MTT法测定细胞增殖抑制率,通过流式细胞术检测细胞周期、观察细胞凋亡状况并计算凋亡率,RT-PCR法检测bcl-2 m RNA和Bax mRNA表达并计算Bax/bcl-2表达比值,Western blot法检测降解型caspase-3蛋白表达。结果 UA各组和顺铂组Hep-2细胞较空白对照组出现明显损伤,以UA 50μmol·L^(-1)组最为显著;UA(25、50μmol·L^(-1))组和顺铂组Hep-2细胞增殖抑制率显著升高,G0/G1期显著增长、G2/M期显著缩短,细胞凋亡率显著升高,细胞中bcl-2 m RNA表达显著下调且Bax mRNA显著上调、Bax/bcl-2表达比值显著升高,降解型caspase-3蛋白表达显著上调(P<0.05,P<0.01)。结论 UA能够抑制人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖并促进其凋亡,提示UA对Hep-2细胞生长具有抑制作用,其作用机制可能与UA能够改变细胞周期以及调节凋亡相关基因和蛋白表达有关。

siRNA沉默eIF4E诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其机制

目的:观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)对喉癌Hep-2细胞中eIF4E基因表达的影响,探讨其诱导喉癌细胞凋亡的作用机制。方法:采用脂质体LipofectamineTM2000将siRNA-eIF4E转染入人喉癌Hep-2细胞(siRNA-eIF4E组),同时设空白对照组和空质粒组。MTT法检测siRNA对Hep-2细胞增殖的抑制作用,罗丹明染色检测转染后细胞内线粒体膜电位的变化,TUNEL染色法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blotting法检测凋亡相关基因转录和蛋白表达水平的变化。结果:与空白对照组及空质粒组比较,siRNA-eIF4E组Hep-2细胞中eIF4E基因转录和表达水平明显下调(P<0.01),Hep-2细胞生存率下降(P<0.05),细胞线粒体膜电位降低(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),凋亡相关基因Bim、Bid及Caspase-3表达上调(P<0.05)。结论:siRNA-eIF4E在体外可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖,其机制可能是通过激活线粒体凋亡途径诱导Hep-2细胞凋亡。

E1A基因对喉癌Hep-2细胞体外生长和增殖的影响

目的探讨E1 A基因与喉癌Hep-2细胞生长和增殖的关系。方法将Ad-E1 A和对照空载体组Ad-β-gal在2 9 3细胞中扩增后提取、纯化并滴定,将其转染至喉癌Hep-2细胞,转染后将Hep-2细胞分为空白组(PBS组)、对照组(Ad-β-gal)和实验组(Ad-E1A组)。经RT-PCR鉴定,采用胎盘兰染色并计算细胞数及MTT法绘制细胞生长曲线并计算倍增时间;采用流式细胞术计算分析细胞周期。结果RT-PCR结果显示E1 A已整合到Ad-E1 A转染的细胞基因组中并且稳定表达。实验组(E1 A组)细胞生长减慢,倍增时间分别是空白组(PBS组)、对照组(Ad-β-gal组)的1.7 2倍和1.7 0倍。流式细胞术结果显示转染E1 A的细胞出现S期减少和G2/M期被阻滞。结论①E1 A基因可以抑制喉癌Hep-2细胞在体外的生长,延长其倍增时间。②E1 A基因可以改变喉癌Hep-2细胞的细胞周期,使S期细胞减少,G2/M期被阻滞。

喉鳞癌中CDK2对细胞周期的影响及其意义

目的探讨喉鳞癌组织CDK2激酶表达与肿瘤细胞增殖之间的关系。方法取手术中获得的50例喉鳞癌组织,12例非典型增生组织和30例声带息肉组织,用免疫组化的方法检测CDK2与PCNA的表达;用流式细胞术检测喉鳞癌组织细胞周期比率。结果在喉鳞癌组织中CDK2与PCNA的阳性率表达分别为68.0%和86.0%,显著高于声带息肉组织(P<0.05);并且CDK2的表达与临床分期、病理分级、淋巴转移密切相关,与患者的年龄、性别和原发部位无关。结论喉鳞癌中CDK2过度表达可能与肿瘤细胞增殖异常密切相关。在诊断和治疗喉鳞癌中,CDK2可能是一个有重要作用的指标。

miR-126对人喉鳞癌Hep2细胞迁移侵袭能力的影响

目的探讨miR-126对人喉鳞癌Hep2细胞迁移侵袭能力的影响。方法采用脂质体Lipofectamine TM 3000将miR-126 mimics和miR-126 NC转入Hep2细胞中,Realtime-PCR检测miR-126表达,MTT法检测细胞活力,tanswell实验检测细胞迁移及侵袭能力,Western印迹检测细胞中基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、锌指转录因子(Snail)、锌指结合蛋白(ZEB)1蛋白表达及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的激活情况。结果miR-126 mimics组miR-126表达量高于miR-126 NC组,细胞活力低于miR-126 NC组,细胞迁移数目少于miR-126 NC组,细胞侵袭数目少于miR-126 NC组,MMP2、MMP9、Snail、ZEB1、PI3K及p-AKT蛋白表达量均低于miR-126 NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-126过表达能显著的抑制Hep2喉鳞癌细胞迁移侵袭能力,其机制可能与阻断PI3K/AKT信号通路有关。

钙网织蛋白-短发夹RNA慢病毒载体构建及其对喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中钙网织蛋白表达的影响

目的构建钙网织蛋白(CRT)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,并检测其对喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中CRT表达的影响。方法设计CRT特异性靶序列,合成含有靶序列的线性化载体pSIH1-H1-copGFP,通过转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2筛选基因表达效率最高的靶序列。包装生产CRT-shRNA慢病毒并测定滴度,转染喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测重组慢病毒载体对CRT基因在mRNA和蛋白水平的沉默效果。结果PCR阳性鉴定及测序分析结果显示,插入片段的序列及方向均与预期结果一致。含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2、CRT siRNA3的载体转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2的表达量均低于空白对照组(P﹤0.05)。含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2的载体转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2的基因表达效率均低于CRT siRNA3(P﹤0.05)。经测定,慢病毒载体的滴度为3.5×10^7 TU/ml,感染复数(MOI)=30时慢病毒转染至Hep-2细胞的转染率在90%以上。实时PCR结果显示,shRNA组中CRT基因的表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P﹤0.05)。Western blot结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,shRNA组喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中CRT蛋白的表达水平明显下降。结论成功构建针对CRT的重组慢病毒载体可有效抑制喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中CRT的表达,为后续研究CRT基因的功能提供了实验工具。

miR-21对人喉鳞癌Hep2细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨miR-21对人喉鳞癌Hep2细胞增殖与凋亡的影响。方法脂质体LipofectamineTM2000将miR-21inhibitor和miR-21阴性对照(NC)转入Hela细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,克隆实验及Hoechst染色分别检测细胞增殖与凋亡情况,Western blot检测人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)、程序化死亡蛋白4基因(PDCD4)、Bax、Bcl-2表达及蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平。结果与miR-21NC比较,miR-21inhibitor能显著抑制细胞活力[(0.728±0.045)vs.(0.393±0.018),P<0.01],降低细胞克隆数目[(158.38±14.47)vs.(65.52±6.86),P<0.01],提高细胞凋亡率[(8.45±0.67)%vs.(40.23±3.46)%,P<0.01],并上调PTEN、PDCD4、Bax表达,下调Bcl-2表达及降低AKT磷酸化水平(P<0.01)。结论 miR-21inhibitor通过PTEN/AKT信号通路抑制人喉鳞癌Hep2细胞增殖和诱导凋亡,并调节细胞凋亡相关蛋白的表达。