基于鲁米诺增强发光体系的喹乙醇CLEIA技术研究

为建立高效的喹乙醇化学发光酶免疫检测方法(OLA-CLEIA),本研究以鲁米诺-HRP-H2O2增强体系为发光体系,探究OLA-CLEIA的最佳化学发光条件和免疫反应条件,并采用高效液相色谱法(HPLC)进行验证。结果表明,化学发光的最佳条件为鲁米诺浓度1.0 mmol·L^(-1),H2O2浓度2.0 mmol·L^(-1)、稀释比1500,4-溴苯酚浓度2.0 mmol·L^(-1),4%的二甲基亚砜(DMSO)助溶,三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液浓度0.02 mol·L^(-1)、pH值9.0;间接竞争免疫反应的最佳条件为包被抗原浓度0.94μg·mL^(-1),抗体稀释比1∶4800;根据抑制率与喹乙醇浓度得到的线性回归方程为y=17.305 lnx+3.6224,R2=0.9971,检测限(IC10)和灵敏度(IC50)分别为1.45、14.60 ng·mL^(-1);对鱼饲料样品的加标回收率为91.0%~104.0%,批内、批间精密度变异系数均低于6.0%;通过HPLC测得OLA-CLEIA具有较高的准确性与稳定性。综上,本研究建立的OLA-CLEIA具有准确可靠、操作简便、特异性强等优点,可用于多种饲料中喹乙醇的残留检测分析。本研究可为其他小分子残留的CLEIA技术提供参考。

浅谈饲料中喹乙醇(Olaquindox)检测技术

目前鱼用饲料检测中还没有一个完善的方法测定喹乙醇项目,只是参考出口肉中喹乙醇的检测方法。本文作者根据几年对鱼用饲料检测有关情况作一探讨。

喹乙醇对体外卵母细胞及胚胎发育的影响

喹乙醇(Olaquindox,OLA)作为有效的抗菌药剂,广泛应用于畜禽养殖业.然而,喹乙醇是否对体外卵母细胞及胚胎发育有影响尚不清楚.本实验采用不同浓度喹乙醇(0.1 mM,0.5 mM,1.0 mM,2.0 mM,5.0 mM)对体外获取生发泡(Germinal vesicle,GV)期卵母细胞体外培养,观察卵母细胞的体外成熟率.其次,对实验组体外成熟卵母细胞进行激活发育,统计卵细胞激活率.最后,使用喹乙醇处理体外受精卵观察胚胎发育情况,观察胚胎各阶段发育率并通过荧光定量PCR囊胚期OCT4(Octamer-binding transcription factor 4,OCT4)、CDX2(Caudal type homeobox 2,CDX2)基因表达水平.实验结果显示,1.0 mM、2.0 mM、5.0 mM OLA处理GV期卵母细胞显著阻碍卵母细胞成熟(P<0.05);5.0 mM处理下卵母细胞激活率显著降低(P<0.01).同时,高剂量的喹乙醇处理下,早期胚胎囊胚发育受阻,相关发育基因OCT4、CDX2 mRNA表达水平呈显著下降.

超高效液相色谱串联质谱法同时测定渔用非药品类投入品中喹乙醇、氯霉素类、硝基呋喃类药物残留

本实验旨在建立超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)同时测定渔用非药品类投入品中喹乙醇、氯霉素类、硝基呋喃类共8种药物残留的检测方法。使用乙腈作为提取剂,在避光的环境中对投入品中的8种药物进行涡旋超声提取,使用固相萃取柱对提取液进行净化后仪器分析,液相色谱以水和乙腈作为流动,使用BEH C18色谱柱对药物进行分离,质谱使用正负离子切换模式进行同时扫描,喹乙醇和硝基呋喃类药物使用基质匹配标线外标法定量,氯霉素类药物以氘代氯霉素作为内标物使用基质匹配标线内标法定量。结果表明:喹乙醇和硝基呋喃类的线性范围为0.5~20.0 ng/mL,氯霉素类的线性范围为0.2~20.0 ng/mL,标准曲线的相关系数为0.9987~0.9996,8种药物的方法检测限为1.0~2.5μg/kg,定量限为2.5~5.0μg/kg。使用2种空白投入品进行3个浓度的加标实验,回收率为75.5%~102.2%,相对标准偏差为2.8%~10.2%。本方法可同时对8种药物进行提取测定,检测效率较高,同时方法的准确度和精密度较好,可以用于渔用非药品类投入品中8种药物残留的测定。

胶体金免疫层析法快速检测动物肌肉组织中喹乙醇代谢物

目的优化胶体金免疫层析法快速检测动物肌肉组织中喹乙醇代谢物。方法样品中的喹乙醇残留标志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸经盐酸水解、乙腈提取、磷酸缓冲盐溶液复溶,用于胶体金试纸条的检测。依据GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》拟定检出限,筛选符合要求的快速检测产品,根据《市场监管总局关于规范食品快速检测使用的意见》(国市监食检规〔2023〕1号)对快速检测产品进行评价,初步确定该方法的性能指标和交叉反应率要求,并与液相色谱-质谱法进行一致性分析。结果该方法适用于猪、鸡、鱼和虾肌肉组织的检测,猪肉的检出限为4μg/kg,鸡肉、鱼肉、虾肉的检出限为0.5μg/kg,方法灵敏度≥95%、特异性≥95%、假阴性率≤5%、假阳性率≤5%;卡巴氧代谢物喹噁啉-2-羧酸的交叉反应率≤8.0%,喹乙醇、卡巴氧、乙酰甲喹、乙酰甲喹代谢物2-(1-羟乙基)-3-甲基喹噁啉-1,4-二氧化物的交叉反应率<0.1%。该方法测定结果与液相色谱-质谱法一致。结论该方法前处理简单、快速准确,适用于喹乙醇残留物的快速筛查与确证,为喹乙醇残留物快速检测的研发与监测提供综合性的技术手段。

喹乙醇在鲤体内的药物代谢动力学及组织浓度

采用高效液相色谱法测定了鲤血浆及组织中喹乙醇的浓度。该法采用C1 8色谱柱 ,流动相为甲醇—三蒸水(1 5∶85) ,检测波长为 372nm ,样品用 1 5 %的三氯乙酸沉淀蛋白 ,离心取上清液进样。该法灵敏、简便、准确、喹乙醇在 0 2— 2 5 6μg/mL浓度范围内线性关系良好 ,检测限为 0 0 4 μg/g ,平均回收率为 85 93 %— 1 0 0 2 % ,不同浓度水平的日内和日间精密度测定结果均小于 1 0 %。以 30mg/kg鱼体重的剂量口灌给药 ,通过对喹乙醇在鲤体内的血药浓度经时曲线过程分析 ,发现其符合一级吸收一室开放模型 ,主要动力学参数如下 :消除相半衰期T1 / 2k5 876h ,吸收相半衰期T1 / 2ka1 466h ,达峰时间Tp3 91 3h ,达峰浓度Cmax3 0 2 5ug/mL ,血药浓度 时间曲线下面积AUC 40 6 92mg/L·h ;并对用药后组织药物浓度和单次、多次灌药后肌肉中喹乙醇的残留量及以原型排出体外的喹乙醇进行了测定 ,获得了单次灌药后鲤肌肉、肝脏、肾脏和多次灌药后鲤肌肉中喹乙醇的代谢规律 ,测得原型药物排出体外的量占总灌药量的 6 9%。该项研究全面了解了喹乙醇在鱼体内的药动学特征 。

喹乙醇对鲤肝胰脏抗氧化酶系统的影响

用含不同剂量喹乙醇(0～3200mg·kg-1)的饲料饲喂鲤,分别对鲤在摄食3、6、9和12周时肝胰脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH px)等抗氧化酶活性、脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量及总抗氧化能力(T AOC)进行了测定。结果表明,SOD活性随饲料喹乙醇剂量的升高总体上呈升高的趋势,试验时间对各个处理组的SOD酶活性影响不大。饲料中喹乙醇对GSH px活性的影响较小,其剂量达1600mg·kg-1以上时GSH-px酶活性变化明显,主要表现为诱导效应。饲料中喹乙醇剂量的改变大体上不对MDA含量产生影响,且随时间的延长,除3200mg·kg-1组外,其余各实验组的MDA含量都有所降低。随喹乙醇剂量的增加和实验时间的延长,T AOC均呈现降低的趋势,其中以1600和3200mg·kg-1组的下降幅度最大。结果提示,高剂量下喹乙醇对抗氧化酶活性影响较大,并伴随着机体抗氧化能力的减弱。

粪源抗生素金霉素和喹乙醇在养殖水体中的残留及对锦鲤的生态毒理效应研究

用含不同剂量金霉素和喹乙醇的猪粪饲喂锦鲤,分别测定摄食10、20和30d时肌肉组织中抗生素含量、体表和消化道微生物数量,试验结束时对肝脏中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量进行了测定。结果表明,猪粪中金霉素和喹乙醇在养殖水体中溶出存在较大差异,从试验第1d到结束养殖水体中喹乙醇浓度Ⅲ和Ⅳ组分别为0.05～0.32mg·kg-1和0.12～0.70mg·kg-1,锦鲤肌肉组织中喹乙醇浓度Ⅲ和Ⅳ组在试验的10、20和30d分别为1.87、5.25、3.83mg·kg-1和2.96、4.33、4.23mg·kg-1。没有在水环境和锦鲤体内检测到金霉素。锦鲤体表和消化道微生物随着加样次数增加,数量也急剧上升。猪粪中的成分能显著降低SOD酶活性,增加MDA含量,而加入金霉素和喹乙醇也未能使锦鲤肝脏SOD活性和MDA含量恢复到机体正常水平。

液相色谱-串联质谱法测定牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物的残留量

建立了牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物喹喔啉-2．羧酸（QCA）和喹乙醇代谢物3-甲基喹喔啉-2-总羧酸（MQCA）残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。将样品经0．6％（体积分数）的甲酸溶液进行消化，用Tris缓冲溶液调节pH后，加入Protease蛋白酶进行酶解，样品溶液用0．3mol／LHCl溶液酸化后，采用阴离子交换固相萃取柱OasisMAX进行净化和富集。分析样品以0．1％（体积分数）的甲酸溶液-甲醇-乙腈为流动相，经Inertsil ODS-3色谱柱分离，采用负离子扫描，在LC．MS／MS多反应监测模式下进行定性及定量分析。喹吧啉-2-羧酸和3-甲基喹嘿啉-2-羧酸的方法测定下限牛奶为0．5μg／kg，奶粉为4．0μ/Kg。对牛奶在0．5～5．0μg／kg，奶粉在4．0～40．0μg/kg添加水平的平均回收率为68．2％～82．5％，RSD为3．4％～12％。

鲤慢性喹乙醇中毒的病理学和组织残留

试验以含10、25、50、100、150和200mg·kg-1喹乙醇的饲料对鲤进行了慢性毒性试验。经90d的试验,各组的发病率分别为17.5%、27.5%、35.0%、42.5%、47.5%和55.0%,死亡率分别为5.0%、10.0%、12.5%、17.5%、20%和30.0%。中毒鱼表现为特征性的"应激性出血综合征",且Hb含量和RBC数量降低,血清AST、ALT活性升高。病理组织学表现为鳃小片水肿,上皮细胞增生、变性、坏死和脱落。心肌纤维、肾小管上皮细胞和肾上腺细胞空泡变性;肝细胞脂肪变性或水泡变性及溶解坏死;肠道发生卡他性肠炎;超微结构上,心肌纤维、肝细胞和肾小管上皮细胞的线粒体肿胀、嵴断裂、溶解,粗面内质网扩张,核糖体脱颗粒;肝细胞内脂滴明显增多;肠上皮微绒毛脱落、崩解和肠上皮细胞大量坏死脱落。中毒鱼肝、肾和肌肉组织内喹乙醇含量与对照组之间有显著性差异。

喹乙醇对小鼠肝脏和肾脏的毒性作用研究

按毒理学方法给小鼠灌喂不同剂量喹乙醇,探讨喹乙醇对小鼠肝、肾脏功能的影响。结果表明:随着喹乙醇剂量的增加,血液中AST、ALT活性及BUN、Cre含量均升高,CHE活性先升高再下降,血清TP、ALB含量则明显下降。这些变化表明蛋白质合成代谢减慢,分解代谢加强,引起动物生长速度减慢。剖检时肝脏肿大、瘀血,质脆易碎,1/10LD50组和1/5 LD50组肝细胞变性、坏死,肾小管上皮细胞高度肿胀、变性、脱落,肾小球囊腔变狭窄。电镜下1/5 LD50组小鼠肝细胞部分细胞质溶解,细胞器减少,线粒体受损;肾脏近曲小管上皮细胞胞质部分溶解,线粒体嵴有缺损,有液泡,肾小球足细胞部分融合,证实了喹乙醇对肝肾的器质性损害。

高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇的残留量

建立了水产品中喹乙醇残留量的测定方法。主要研究了样品的预处理方法,提出了以水为提取剂,以硼砂 硫酸锌为高效蛋白去除剂的样品处理方法。该方法灵敏、准确,适合于水产品中微量喹乙醇残留量的测定。方法的检出限为40μg/kg。

喹乙醇诱导鲤肝细胞凋亡的研究

Hepatic cells apoptosis induced by olaquindox in common carp, Cyprinus carpio, were studied. The test was conducted for 30 days, with dose of 200mg·kg-1 feed. Terminal deoxynucleotidy transferase mediated dUTP-Biotin nick-end labeling （TUNEL）, electronic microscopic and flow cytometry were performed to analyze apoptosis. The result showed that hepatic cells apoptosis were indentified under light microscope with TUNEL staining; chromatin condensation, chromosal clumping and margination, and apoptotic bodies were observed under electronic microscope; and sub-G1 PEAK （AP peak） in hepatic cells could be detected by flow cytometric method. The apoptotic rate measured by flow cytomtry increased with dye-poison time, on the 7th,14th,20th,25th and 30th day, the apoptotic rate was 2.05%, 6.25%, 9.49%, 13.31% and 17.44% respectively.

喹乙醇人工抗原的合成及鉴定

采用琥珀酸酐法合成了喹乙醇的衍生物喹乙醇-半琥珀酸酯(OLA-SH),并通过TLC、质谱、红外光谱和核磁共振等方法对其进行了鉴定。再分别经活化酯法和氯甲酸异丁酯法合成了喹乙醇的人工抗原(OLA-BSA,OLA-OVA),采用紫外分光光度计法和SDS-PAGE对合成的人工抗原进行了定性鉴定,结果表明人工抗原合成成功。根据半抗原、人工抗原及其载体在259.4nm处的紫外吸光度,计算出两种人工抗原中半抗原与载体的分子结合比率分别为3.8和5.0。

HPLC法同步检测鲤鱼、对虾中喹乙醇与MQCA残留

建立了一种高效液相色谱法同时检测鲤鱼、对虾肌肉组织中喹乙醇(OLA)及其代谢物3-甲基-喹啉-2-羧酸(MQCA)的残留。采用0.3 mol/L盐酸提取鲤鱼、对虾中的残留物,C18固相萃取柱净化,氮气吹干及流动相定容后,Waters2695高效液相色谱仪在320 nm(MQCA)和372 nm(QLA)双波长同步检测,流动相由纯水、乙腈、甲醇和0.5%甲酸水组成,梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,外标法定量。在此条件下,当OLA及MQCA在鱼组织中的添加水平分别为20～200μg/kg和35～200μg/kg时,其平均回收率相应为83.5%～87.7%和79.6%～87.4%;当OLA及MQCA在虾组织中的添加水平分别为15～200μg/kg和30～200μg/kg时,其平均回收率相应为74.6%～80.9%和81.0%～86.6%。两种动物组织中两种化合物的批内相对标准偏差RSD(n=5)为0.51%～4.47%,批间相对标准偏差RSD(n=3)为0.66%～7.58%。鲤鱼组织中OLA和MQCA的检测限分别为6μg/kg和10μg/kg,定量限分别为20μg/kg和35μg/kg;对虾组织中OLA和MQCA的检测限分别为4.5μg/kg和8μg/kg,定量限分别为15μg/kg和30μg/kg。

喹乙醇诱导小鼠睾丸生精细胞凋亡作用研究

按毒理学方法给小鼠灌喂不同剂量喹乙醇,采用原位末端标记法检测该药物饲料添加剂对生精细胞凋亡作用的影响。结果表明:各试验组小鼠生精细胞凋亡指数较正常组和阴性对照组均有所增加,在不同时间,高剂量组均表现差异显著(p<0.05)或极显著(p<0.01),且连续给药8 d和12 d时,喹乙醇各试验组呈现出明显的剂量-效应关系,说明喹乙醇可以诱导小鼠睾丸生精细胞发生凋亡。

喹乙醇对鲤鳃组织Na^+、K^+-ATP酶活性及血浆生化指标的影响

用含不同喹乙醇剂量的饲料饲喂健康鲤鱼种,研究饲料中不同喹乙醇剂量对鲤体成分含量、血浆生化指标以及鲤鳃组织Na+、K+ ATP酶活性的影响,探讨喹乙醇对鲤的生化毒性。试验分成6 个喹乙醇处理组(0、200、400、800、1 600、3 200 mg/kg),试验期60 d。试验结束时分别从各组中采血、取全鱼样和鱼鳃样,进行不同指标测试。结果表明,喹乙醇使鱼体脂肪含量轻度上升,使灰分沉积量显著降低,并呈现剂量-反应关系。与对照组比较,在较高喹乙醇剂量下,谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)活性降幅较大,血浆中葡萄糖(GLU)、胆固醇(CHO)、总胆红素(T-B)、直接胆红素(D-B)、高密度脂蛋白(HDL)、白蛋白(ALB)、K+、Ca2+、P含量升高, 肌酐(CRE)和CO2含量降低,其他测定指标变化不明显。鳃组织中Na+、K+ ATP酶活性随喹乙醇剂量的升高而呈逐渐下降的趋势,呈现剂量效应关系,喹乙醇剂量达1 600 mg/kg以上时,Na+、K+ ATP酶活性显著降低。结论:1 600 mg/kg以上的喹乙醇剂量可以明显干扰鲤的正常生化代谢功能。

喹乙醇在鱼体内蓄积及其对鱼类的影响

本文以含 35 0mg/kg和 4 0 0mg/kg喹乙醇的饲料经 99d分别连续投喂鲤和银鲫 ,以测定喹乙醇在鲤和银鲫体内的蓄积及其对鲤、银鲫的影响。试验结果表明 ,无论是银鲫单养还是鲤鲫混养 ,无论是鲤还是银鲫 ,试验组喹乙醇在肝脏组织中蓄积量最高 ,99d单养银鲫组可达 10 0 5 7± 0 0 15 (3)mg/kg ,鲤鲫混养组银鲫、鲤分别达 10 10 7± 0 2 2 6 (3)mg/kg,9 883± 0 0 32 (3)mg/kg ,肾脏次之 ,99d单养鲫鱼组的银鲫 ,鲤鲫混养组的银鲫、鲤分别为 7 4 94± 0 0 6 4 (3)mg/kg,7 777± 0 138(3)mg/kg和 7 6 0 8± 0 0 86 (3)mg/kg ,肌肉中较低 ,分别为 0 1170± 0 0 0 3(3)mg/kg ,0 16 0± 0 0 0 3(3)mg/kg,0 4 86± 0 0 0 6 (3)mg/kg;经检验三种组织器官中的蓄积量差异显著 (P <0 0 5 )。由于喹乙醇在鱼体内的蓄积 ,虽鲤鲫混养组的银鲫、鲤的相对增重率达到 10 2 7%和 110 7% ,但是它们的抗应激反应率明显下降 ,而且随喹乙醇摄入量的增加下降趋势更为明显 ,当给予一定程度的应激刺激后 ,单养鲫鱼组的银鲫应激反应率由 5 8d的4 4 8%上升到 99d的 6 4 3% ,鲤鲫混养组的银鲫和鲤分别由 5 8d的 6 6 7%和 4 6 2 %分别上升到 99d的 88 3%和76 9% ,无论是 5 8d还是 99d ,试验组与对照组间差异显著

测定饲料中喹乙醇含量的反相高效液相色谱法

建立了高效液相色谱法测定饲料中喹乙醇含量的方法 ;饲料用甲醇 -水提取 ,在380nm波长下检测 ,色谱柱为NOVA_PakC18(3.9mm×150mm ,4μm) ,流动相为甲醇 -水 (体积比为10∶90) ,流速为1.0mL/min ,喹乙醇质量浓度在2.5～20.0mg/L范围内与峰面积呈良好线性关系 ,相对标准偏差为1.2 %～1.6 % ,回收率为97 %～101%。

兽药添加剂喹乙醇的生态毒理学效应研究

采用水生生物斑马鱼(Daniorerio)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)和土壤生物赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)作为生物材料,通过斑马鱼急性毒性试验、斑马鱼胚胎发育试验、鲤鱼肾细胞单细胞凝胶电泳试验、蚯蚓急性毒性试验、蚯蚓生化毒性试验以及蚯蚓体腔细胞单细胞凝胶电泳试验,对兽药添加剂喹乙醇分别从生物个体、细胞和分子水平进行了生态毒理学效应研究。急性毒性试验结果表明,喹乙醇实验浓度范围内对斑马鱼和蚯蚓的急性毒性均不大。胚胎发育试验结果表明,喹乙醇对斑马鱼胚胎的72hEC50为221.20mg·L-1,具有明显致畸效应。蚯蚓生化毒性试验表明,喹乙醇能促进蚯蚓体内SOD酶活性,并呈现一定剂量-效应关系,但对纤维素酶影响不明显,单细胞凝胶电泳试验结果表明,喹乙醇具有一定遗传毒性,能引起鲤鱼肾脏细胞和蚯蚓体腔细胞DNA损伤,与空白对照相比有显著差异,并呈现出一定剂量-效应关系。