结核分枝杆菌和卡介苗菌株中喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRT)的原核表达及酶活性测定

为了在原核表达系统E.coli中表达并纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis)H37Ra和卡介苗菌株(Mycobacterium bovis bacilli-Calmette-Guerin,BCG)str.Pasteur 1173P2的喹啉酸磷酸核糖转移酶(quinolinic acid phosphoribosyl transferase,QPRT),探索不同来源QPRT蛋白结构,并测定其酶活性,试验采用PCR方法分别对M.tuberculosis和BCG中QPRT的编码基因nadC进行扩增,与pET-28a载体连接构建重组载体并在E.coli中完成原核蛋白的表达,在体外进行目的蛋白的纯化,利用高效液相色谱法检测不同来源的QPRT蛋白酶活性,使用PyMOL v2.3.2软件分析其氨基酸残基结构。结果表明:在体外成功克隆了M.tuberculosis和BCG中的大小为858 bp的编码基因nadC,并成功构建出重组载体pET-28a-nadC-MTB和pET-28a-nadC-BCG,在E.coli中进行QPRT蛋白的表达与体外纯化后获得分子量为34 ku的QPRT蛋白;两种不同菌株来源的QPRT蛋白以喹啉酸(quinolinic acid,QA)为底物时酶活性无差异;不同来源的QPRT蛋白中存在1个差异氨基酸残基位点,但酶活性并无明显差异。说明QA的结构类似物吡嗪酸(pyrazinoic acid,POA)不是QPRT的底物,为抗结核药物靶点的探索提供了潜在价值。

大肠杆菌来源的喹啉酸磷酸核糖转移酶和烟酸磷酸核糖转移酶的表达纯化及酶活性的初步检测

【目的】在原核表达体系中实现大肠杆菌来源的喹啉酸磷酸核糖转移酶(Quinolinic acid phosphoribosyl transferase,QPRT)和烟酸磷酸核糖转移酶(Nicotinic acidphosphoribosyl transferase,NaPPT)的表达与纯化,并利用酶的生物催化作用实现2,3-二羧酸喹啉的2位选择性脱羧得到烟酸【。方法】通过PCR扩增分别得到编码QPRT和NaPPT的基因片段,构建成原核表达质粒pET28a-NadC和pRSETB-PncB,在Escherichia coli(E.coli)中对其进行表达,在体外对目标蛋白进行纯化并利用高效液相色谱法(HPLC)检测酶催化反应的发生。【结果】成功表达纯化得到QPRT和NaPPT,检测结果表明在这两个酶的生物催化作用下可实现喹啉酸的2位选择性脱羧。

QPRT基因功能缺失对肾脏发育的影响

目的:研究喹啉磷酸核糖基转移酶(quinolinic phosphoribosyl transferase,QPRT)基因功能缺失对胚胎肾脏发育的影响。方法:通过免疫组化确定QPRT在胎鼠肾脏组织的表达;构建QPRT基因缺陷型小鼠模型,取QPRT+/+(WT)型和QPRT-/-(KO)型小鼠的血清进行肾功能检测;称重法计算KO及WT组小鼠的体重、肾脏重量及肾脏系数;用HE染色观察小鼠及其子代肾脏病理组织学变化。结果:在妊娠13 d胎鼠肾脏组织,QPRT在发育中的输尿管芽中强烈表达。在基因敲除小鼠模型中,QPRT-/-小鼠的肾脏系数(肾重/体重)显著低于野生型小鼠(P<0.05),且QPRT-/-小鼠的尿素氮、血肌酐、尿酸水平高于野生型组(P<0.05)。肾脏组织HE染色显示QPRT-/-仔鼠的肾脏实质部位局部呈现蜂窝状囊性扩张;QPRT+/-仔鼠见肾脏皮质间质局灶性疏松水肿;QPRT+/+仔鼠肾脏未见明显病理组织学变化。结论:QPRT基因功能缺失可能影响胚胎肾脏发育。