结核分枝杆菌和卡介苗菌株中喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRT)的原核表达及酶活性测定

为了在原核表达系统E.coli中表达并纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis)H37Ra和卡介苗菌株(Mycobacterium bovis bacilli-Calmette-Guerin,BCG)str.Pasteur 1173P2的喹啉酸磷酸核糖转移酶(quinolinic acid phosphoribosyl transferase,QPRT),探索不同来源QPRT蛋白结构,并测定其酶活性,试验采用PCR方法分别对M.tuberculosis和BCG中QPRT的编码基因nadC进行扩增,与pET-28a载体连接构建重组载体并在E.coli中完成原核蛋白的表达,在体外进行目的蛋白的纯化,利用高效液相色谱法检测不同来源的QPRT蛋白酶活性,使用PyMOL v2.3.2软件分析其氨基酸残基结构。结果表明:在体外成功克隆了M.tuberculosis和BCG中的大小为858 bp的编码基因nadC,并成功构建出重组载体pET-28a-nadC-MTB和pET-28a-nadC-BCG,在E.coli中进行QPRT蛋白的表达与体外纯化后获得分子量为34 ku的QPRT蛋白;两种不同菌株来源的QPRT蛋白以喹啉酸(quinolinic acid,QA)为底物时酶活性无差异;不同来源的QPRT蛋白中存在1个差异氨基酸残基位点,但酶活性并无明显差异。说明QA的结构类似物吡嗪酸(pyrazinoic acid,POA)不是QPRT的底物,为抗结核药物靶点的探索提供了潜在价值。

喹啉酸磷酸核糖转移酶与疾病的研究进展

喹啉酸磷酸核糖转移酶(quinolinate phosphoribosyltransferase,QPRT)是色氨酸代谢过程中的关键酶,近年来,研究发现QPRT不仅参与诸多神经系统疾病的发病机制,还与感染性疾病、肿瘤的发生有关,本文就此进行综述。1QPRT生物学特性QPRT是磷酸核糖转移酶家族成员,通过催化喹啉酸(quinolinic acid,QA)的分解,参与NAD的从头合成途径。

基于生物信息学分析喹啉酸磷酸核糖基转移酶在恶性黑色素瘤中的表达及潜在生物学功能

目的通过生物信息学方法分析喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPRT)在恶性黑色素瘤中的表达及潜在生物学功能。方法应用癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达综合数据库(GEO)检索恶性黑色素瘤患者的临床资料。应用基因表达谱互动分析(GEPIA)数据库对TCGA数据库中恶性黑色素瘤组织和正常皮肤组织中QPRT mRNA表达水平进行分析。应用UALCAN数据库对TCGA数据库中不同临床分期恶性黑色素瘤组织中QPRT mRNA的表达水平进行分析。应用GEPIA数据库分析不同QPRT mRNA表达情况恶性黑色素瘤患者的预后。应用人类蛋白质参考数据库(HPRD)分析正常皮肤组织、原发性黑色素瘤组织及转移性黑色素瘤组织中QPRT蛋白的表达情况。应用GeneMANIA数据库查找与QPRT相互作用的蛋白,将与QPRT相互作用的关键基因利用WebGestalt进行基因本体(GO)分析,了解其参与的细胞组分、生物过程、生物功能。结果恶性黑色素瘤组织中QPRT mRNA表达水平明显高于正常皮肤组织,差异有统计学意义(P﹤0.01)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期恶性黑色素瘤患者的QPRT mRNA表达水平比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。QPRT低表达组患者的总生存情况和无病生存情况均优于QPRT高表达组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。免疫组化显示,正常皮肤组织中QPRT蛋白阴性表达,恶性黑色素瘤组织中QPRT蛋白呈强阳性表达。GeneMANIA数据库中筛选出20个与QPRT相互作用的蛋白,相关关键基因主要参与蛋白结合、离子结合、核酸结合及转运活性等。结论QPRT基因在恶性黑色素瘤中高表达,其高表达与恶性黑色素瘤患者的预后不良相关,可能成为筛查恶性黑色素瘤的标志物及治疗靶点。

大肠杆菌来源的喹啉酸磷酸核糖转移酶和烟酸磷酸核糖转移酶的表达纯化及酶活性的初步检测

【目的】在原核表达体系中实现大肠杆菌来源的喹啉酸磷酸核糖转移酶(Quinolinic acid phosphoribosyl transferase,QPRT)和烟酸磷酸核糖转移酶(Nicotinic acidphosphoribosyl transferase,NaPPT)的表达与纯化,并利用酶的生物催化作用实现2,3-二羧酸喹啉的2位选择性脱羧得到烟酸【。方法】通过PCR扩增分别得到编码QPRT和NaPPT的基因片段,构建成原核表达质粒pET28a-NadC和pRSETB-PncB,在Escherichia coli(E.coli)中对其进行表达,在体外对目标蛋白进行纯化并利用高效液相色谱法(HPLC)检测酶催化反应的发生。【结果】成功表达纯化得到QPRT和NaPPT,检测结果表明在这两个酶的生物催化作用下可实现喹啉酸的2位选择性脱羧。

甲硫腺苷磷酸化酶、组蛋白赖氨酸三甲基转移酶蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义

目的探讨甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)、组蛋白赖氨酸三甲基转移酶(SETD2)蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义。方法将2018年11月至2019年11月在苏州市中西医结合医院进行手术治疗并经术后病理学检查证实的86例结直肠癌病人作为研究对象,并收集齐其癌组织标本以及对应的癌旁组织标本。采用免疫组织化学染色法检测所有标本MTAP、SETD2蛋白表达水平。采用χ^(2)检验和多因素Cox回归法探讨MTAP、SETD2蛋白表达与结直肠癌病人临床病理特征、预后的关系。结果结直肠癌组织中MTAP、SETD2阳性表达率(30.23%、27.91%)分别低于癌旁组织(58.14%、62.79%)(P<0.05)。MTAP、SETD2阳性表达水平随着TNM分期越晚、分化程度越低、伴有淋巴结转移而降低(P<0.05)。MTAP阳性3年生存率(73.08%)明显高于阴性(43.33%)(P=0.011);SETD2阳性3年生存率(70.83%)高于阴性(45.16%)(P=0.011)。单因素、多因素分析得出,TNMⅢ~Ⅳ期、伴淋巴结转移、低分化、MTAP阴性、SETD2阴性表达均为影响结直肠癌预后的危险因素(P<0.05)。结论直肠癌组织中MTAP、SETD2蛋白均呈低表达,其表达水平可能参与疾病发展,可成为评估病人预后不良的有效生物学指标。

烟酰胺磷酸核糖转移酶在小鼠心肌梗死后修复中的表达变化与功能研究

目的:探讨心肌梗死后烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)表达变化及其对小鼠心肌细胞增殖的影响,为治疗心肌梗死探索新的理论依据与干预靶点。方法:分离原代乳鼠心肌细胞,给予NAMPT重组蛋白100 ng/ml,利用免疫荧光染色检测心肌细胞的磷酸化组蛋白H3(pH3)、增殖抗原Ki67表达。将成年C57BL/6j雄性小鼠40只随机分成2组:NAMPT治疗组,磷酸盐缓冲液(PBS)对照组,每组20只,同时取10只作为假手术组。通过结扎小鼠冠状动脉左前降支建立小鼠心肌梗死模型,NAMPT治疗组于结扎线以下通过显微心肌内注射NAMPT重组蛋白0.5μg,PBS对照组以同样方法注射PBS溶液,假手术组仅开胸不结扎冠状动脉。通过M型超声检测小鼠术后心功能,取出心脏后Masson染色在光学显微镜下观察并测定心肌梗死面积。结果:左前降支结扎构建心肌梗死模型的小鼠在术后第2、3天NAMPT的信使RNA(mRNA)均显著下调(P均<0.05)。NAMPT处理原代心肌细胞后,与PBS对照组相比,pH3、Ki67阳性心肌细胞比例差异均无统计学意义(P均>0.05),心肌内注射NAMPT的乳鼠心脏中pH3阳性的心肌细胞较PBS对照组也无明显增多(P>0.05)。心肌梗死小鼠NAMPT给药后,与PBS对照组相比,NAMPT治疗组的左心室射血分数和左心室缩短分数差异均无统计学意义(P均>0.05),NAMPT治疗组的心重、体重、心重/体重比值差异均无统计学意义(P均>0.05);两组间梗死面积差异无统计学意义(P>0.05)。结论:心肌梗死损伤会导致心肌组织中NAMPT表达水平下调;但外源性补给NAMPT不能改善小鼠心肌梗死后的心功能,不能减小梗死面积,NAMPT在心肌梗死损伤修复中的作用有待进一步探究。

寄生原虫嘌呤磷酸核糖转移酶研究进展

寄生原虫是一类单细胞寄生性原虫,包括利什曼原虫(Leishmania spp.)、锥虫(Trypanosoma spp.)、疟原虫(Plasmodium spp.)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)和艾美耳球虫(Eimeria spp.)等,可引起严重危害人类与动物健康以及对养殖业造成巨大经济损失的原虫病。寄生虫入侵宿主后的发育和繁殖需要大量的嘌呤核苷酸,相应的嘌呤碱基在嘌呤磷酸核糖转移酶的催化下生成对应的嘌呤核苷酸。嘌呤磷酸核糖转移酶是一类参与嘌呤核苷酸补救合成的重要代谢酶,广泛存在于寄生原虫中。寄生原虫的嘌呤磷酸核糖转移酶主要包括腺嘌呤磷酸核糖转移酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶,两者在寄生原虫中分别催化腺嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和黄嘌呤核苷酸合成,从而参与寄生原虫的多个生化代谢过程,不仅为寄生原虫核酸生物合成等提供前体物质,还为虫体提供通用能量载体。由于寄生原虫的嘌呤补救途径明显区别于宿主的从头合成途径,且嘌呤磷酸核糖转移酶是寄生原虫嘌呤补救途径的关键酶,因而近年来寄生原虫嘌呤磷酸核糖转移酶成为抗原虫药物候选靶标的研究热点,以寄生原虫嘌呤磷酸核糖转移酶为潜在靶标,特异性筛选、设计抑制剂,并开发抗寄生原虫药物取得重要进展。以利什曼原虫、锥虫、疟原虫和弓形虫的嘌呤磷酸核糖转移酶为重点,综述寄生原虫嘌呤磷酸核糖转移酶的基本特征、生物学功能、抑制剂筛选与应用的研究进展,以期为抗寄生原虫药物靶标研究与新型抑制剂筛选提供参考。

日本血吸虫中国株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的克隆、表达及其免疫保护性研究(英文)

根据基因库中日本血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)EST(BU803192)以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgt11多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjHGPRT基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用电子软件拼接,获得SjHGPRT全长cDNA(1270bp),经序列分析,推断该片段含有编码SjHGPRT基因的完整阅读框,其编码基因与曼氏血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(SmHGPRT)全长编码基因碱基一致性为82%,其理论推导的氨基酸组成与曼氏血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的一致性约为83%.将其编码基因克隆到表达载体pQE30上,在大肠杆菌M15中获得准确、高效表达,表达产物分子质量约为28ku.用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对表达产物进行蛋白质印迹检测,在预测位置上出现明显的识别条带.重组蛋白动物免疫保护性结果显示:在虫荷、每克肝卵、每克粪卵和雌子宫内卵数方面,疫苗组与对照组比较差异均具有显著性(P<0.05,P<0.01).结果表明,日本血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(SjHGPRT)全长cDNA成功克隆并在大肠菌中得到表达,表达产物具有良好的抗原性和动物免疫保护效果,是一种潜在的具有部分免疫保护性的抗血吸虫病疫苗候选分子.

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶研究进展

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase,HPRT)是一种细胞质酶,在体内广泛存在,它不仅参与嘌呤碱基的补救合成途径,而且关系到嘌呤类药物的代谢,是调控该类药物药理效应和毒性反应的关键酶。其基因突变可影响酶的活性,不仅可能导致不同临床表现的代谢疾病的发生,而且影响体内嘌呤类药物的代谢。同时,HPRT作为管家基因,是诊断许多疾病的靶点基因。文章概括了HPRT研究的新进展,通过总结国内外研究现状,发现HPRT的研究既推动了嘌呤类药物个体化用药的发展及新药物的研发,又促进了HPRT突变相关遗传代谢疾病的诊断和治疗。

日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶的生物信息学鉴定与分析

目的鉴定日本血吸虫中存在的腺嘌呤磷酸核糖转移酶,分析其蛋白结构特征。方法采用双向同源比对、结构域搜索和系统发育分析等生物信息学手段,在已有转录组和蛋白质组数据基础上鉴定日本血吸虫的腺嘌呤磷酸核糖转移酶,并采用同源建模方法获得日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶的结构特征。结果获得了2条腺嘌呤磷酸核糖转移酶的同源蛋白序列;分析了这2条序列的EST丰度、理化性质及蛋白三维结构等信息。结论日本血吸虫至少存在2个腺嘌呤磷酸核糖转移酶的异构体。

乳清酸磷酸核糖转移酶和结直肠癌化疗毒性的相关性

目的研究结直肠癌患者乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)的表达及其同化疗毒性的相关性。方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测58例结直肠癌组织及癌旁正常组织OPRT的表达,同时观察患者接受FOLFOX6方案化疗的毒性,分析二者的相关性。结果结直肠癌组织OPRT的表达高于相应正常肠粘膜组织,差异具有显著性(P=0.001)。结直肠癌组织OPRT的表达状况和化疗反应无明显相关性(P>0.05)。正常组织OPRT水平和腹泻的发生呈正相关,并具有统计学意义(P=0.013)。结论结直肠癌组织OPRT的表达和结直肠患者的化疗毒性无相关;而癌旁正常组织OPRT的表达可以预测5-FU相关毒性的发生情况。

siRNA抑制弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的表达

目的探讨小干扰RNA(siRNA)在弓形虫体内的对目的基因的表达调节作用。方法以弓形虫嘌呤代谢过程中的关键酶——次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)编码基因为靶标,合成3对siRNA,以电穿孔的方式将不同的浓度的siRNA转染弓形虫。采用荧光定量PCR及[3H]-次黄嘌呤摄入量分别检测弓形虫HXGPRT mRNA及酶合成量。结果在针对HXGPRT编码基因设计的3对21nt的siRNA中,有1对(siRNA415)能明显降低HXGPRT mRNA水平及酶合成量。在转染后24h,4μmol/LsiRNA415电转弓形虫的HXGPRT mRNA水平及[3H]-次黄嘌呤摄入量分别降为模拟电转弓形虫的0.36±0.04及0.51±0.03倍(P<0.05)。结论21nt的siRNA在弓形虫体内能有效抑制目的基因的表达。siRNA在弓形虫体内的应用将为阐明未知基因的功能和抗弓形虫药物的筛选提供有力的工具。

mdrl启动子调控胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因对卵巢癌裸鼠耐药移植瘤的抑制作用

目的：观察人多药耐药基因mdr1启动子调控的胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合自杀基因（CD：：upp）对紫杉醇耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及对荷瘤裸鼠生存时间的影响。方法：建立卵巢癌耐药及非耐药细胞的裸鼠模型，将含mdr1-CD：：upp的重组腺病毒0．1ml（1×10^9pfu／ml）注入裸鼠皮下移植瘤体内，腹腔内注射5-氟胞嘧啶（5-FC），观察各组裸鼠肿瘤生长速度及存活时间。结果：实验组裸鼠移植瘤明显受到抑制，与对照组的差异有统计学意义（P〈0．05）。实验组荷瘤裸鼠的生存时间明显延长，对照组在69天内全部死亡，差异有统计学意义（P〈0．001）。结论：mdr1启动子调控的CD：：upp基因能特异性地抑制卵巢癌裸鼠耐药移植瘤的生长并延长生存时间。

HPLC法测定人红细胞中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性

目的:建立一种检测次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)活性的高效液相色谱法,并检测患者红细胞中HGPRT活性。方法:在5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)条件下,HGPRT催化次黄嘌呤生成次黄嘌呤核苷酸(IMP),高氯酸沉淀蛋白后进行高效液相色谱法分析。采用Hypersil ODS C_(18)(150 mm×4.6 mm,5μm)柱;流动相为磷酸氢盐缓冲液-乙腈(99.6:0.4),流速1 ml·min^(-1),在262 nm处检测IMP。应用新建立的高效液相色谱法测定68例服用过硫唑嘌呤的肾移植患者红细胞中HGPRT活性。结果:在该条件下,测得的线性范围是20～600μmol·L^(-1),检测限是20μmol·L^(-1),其日间和日内精密度均小于5%,方法回收率和提取回收率分别在100.81%～101.91%和99.05%～101.40%范围内。65例患者红细胞HGPRT活性范围为44.59～123.86 U,平均(87.83±21.55)U。结论:该法操作简便、灵敏度高、重复性好,适用于临床常规检测。

沉默尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因OfUGT逆转亚洲玉米螟对Cry1Ie蛋白的抗性

转Bacillus thuringiensis(Bt)基因作物在害虫防治中应用较多,但长期种植转Bt基因作物,靶标害虫不可避免会对杀虫蛋白产生抗性,如何进行抗性治理是当前面临的难题。本研究基于前期转录组分析结果,定量分析了尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因(Of UGT)在亚洲玉米螟Cry1Ie抗性品系(ACB-IeR)及敏感品系(ACB-Bt S)的表达量,利用RNA干扰技术(RNAi)对ACB-IeR品系Of UGT基因进行沉默,并通过毒力测定试验来检验干扰效果。Of UGT基因在ACB-Ie R三龄幼虫中相对表达量高于ACB-Bt S,并且注射ds UGT后该基因表达量下降。Cry1Ie抗性品系的致死中浓度大于1000.00μg/g,在蛋白浓度为500.00μg/g时,注射ds UGT和ds GFP后的幼虫存活率没有显著性差异,但较空白对照组存活率显著降低;在蛋白浓度为1000.00μg/g时,注射ds GFP后的幼虫存活率较空白对照组降低,注射ds UGT后的幼虫存活率较空白对照和注射ds GFP的都显著降低。由结果可以看出RNAi沉默OfUGT基因后可以降低抗性品系亚洲玉米螟对Cry1Ie蛋白的抗性,但对抗性的逆转程度还需要后续更进一步的研究。

烟酰胺磷酸核糖转移酶及其与肿瘤关系研究进展

烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)是哺乳动物细胞合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的限速酶;Nampt也是一种细胞因子,如作为一种新的具有结合并激活胰岛素受体、模拟胰岛素作用的脂肪细胞因子,调控B细胞分化、延缓中性粒细胞凋亡、参与炎症和免疫应答。本文就Nampt的结构、功能及其与肿瘤关系的研究进展作一综述。

长期低剂量接触贫铀方式对大鼠次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因位点及微核变化影响的差异

目的:观察大鼠长期接触低剂量贫铀对外周血淋巴细胞次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因位点及微核的影响,并比较不同接触方式间是否有差别。方法:实验于2004-03/2005-03在解放军第三军医大学创伤烧伤与复合伤国家重点实验室进行。①取初断乳Wistar大鼠26只,雌雄各半,随机分为食入组(n=20)和食入对照组(n=6),食入组以含有50μg/L的贫铀饮水及含70μg/kg贫铀的饲料喂食大鼠,食入对照组普通饮食。②取初成年雄性Wistar大鼠16只,随机分为植入组(n=10)和植入对照组(n=6),植入组大鼠植入贫铀片(0.20±0.02)g,两组均饲喂普通食水。在植入/食入贫铀后第12个月,用颈椎脱臼法处死大鼠,检测其骨髓细胞微核率的改变及采用多核细胞法测定次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因位点突变频率的改变。结果:40只大鼠进入结果分析。①骨髓细胞微核率:食入组与植入组明显高于相应对照组[(0.85±0.14)%,(0.91±0.18)%,(0.09±0.02)%,(0.14±0.08),P<0.05],但食入组与植入组间无差别。②外周血淋巴细胞次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因位点突变频率:食入组和植入组大鼠明显高于相应对照组(0.143%,0.137%,0.109%,0.105%,P<0.05),但食入组与植入组间无差别。结论:长期低剂量接触贫铀,其方式无论是食入、植入均可对大鼠产生致突变作用。

烟酰胺磷酸核糖转移酶在2型糖尿病大鼠糖代谢相关组织中的表达

目的:研究2型糖尿病大鼠机体主要能量代谢器官(肝脏、胰腺、肌肉和肾脏)中烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的表达,探讨Nampt表达和分布与糖尿病发病的关系。方法:腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立SD大鼠糖尿病模型,将大鼠随机分为糖尿病组和对照组。检测大鼠空腹血糖(FBG)和胰岛素分泌水平;采用免疫组织化学Envision染色法检测大鼠肝脏、胰腺、骨骼肌和肾脏组织中Nampt蛋白表达和分布。结果:糖尿病组大鼠FBG水平明显高于对照组(P<0.01),空腹胰岛素水平明显低于对照组(P<0.01)。糖尿病组大鼠肝脏组织Nampt表达明显增高,Nampt蛋白充满全部细胞质;骨骼肌Nampt蛋白表达使整个细胞呈浓染;肾脏细胞Nampt表达主要分布在肾小管上皮细胞内,表达蛋白主要分布于胞浆;与对照组比较,糖尿病组大鼠肝脏、骨骼肌和肾脏组织Nampt阳性表达率明显增高(P<0.05或P<0.01);糖尿病组大鼠胰腺组织几乎未见Nampt表达,Nampt阳性表达率明显低于对照组(P<0.01)。结论:Nampt在糖尿病状态下大鼠主要能量代谢器官中的表达发生明显改变,且呈现出规律性变化,提示Nampt可能成为糖尿病发病过程中的一种特异的指示性标志物。

利用Red同源重组系统构建兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因打靶载体

利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。实验首先在已经筛选到含有兔全长HPRT基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,通过Gap-Repair方式从此克隆上将一段47kb无启动子的HPRT基因组片段(不含有第1个外显子)克隆到pBACLinkSp质粒上,产生pBACLinkSp-rHPRT质粒。然后基于pBACLinkSp-rHPRT质粒,设计不同的同源臂,从而删除了HPRT基因的不同编码区,成功构建了三个不同的HPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。基于实验所构建的三个不同的兔HPRT基因打靶载体,为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件,及进一步获得兔HPRT基因敲除动物疾病模型奠定了基础。

弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆与原核表达

目的克隆弓形虫RH株次黄嘌呤—黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)基因,构建原核表达载体,并表达该重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA,在设计合成的引物中引入BamH和Xho酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT基因片段,插入克隆载体pMD18-T,提取重组质粒,双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株cD-NA中扩增出693bp的HXGPRT基因片段;含pET28a/HXGPRT的宿主菌经诱导后,获得与预期分子量相符的表达产物,Western blotting提示重组蛋白能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体识别,获得纯化的重组蛋白。结论成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取HXGPRT基因,构建pET28a/HXGPRT重组质粒,并高效表达,为进一步研究提供了条件。