酿酒酵母嗜杀质粒（dsRNA）的提取与分离纯化

对酿酒酵母嗜杀质粒的提取、电泳检测及纯化方法进行了研究。以改进的Ｆｒｉｅｄ和Ｆｉｎｋ方法在不预破细胞壁的情况下。巯基乙醇在碱性条件（ｐＨ９．３）预处理后，直拉以ＳＤＳ－苯酚抽提完整细胞分离到了嗜杀质粒（ｄｓＲＮＡ）。在此基础上，以电泳透析方法获得了纯化的Ｍ２和Ｌ双链ＲＮＡ，琼脂糖凝胶电游泳测定分子大小分为１．５ｋｂ和４．０ｋｂ。

具有嗜杀质粒(killer plasmid)酵母菌嗜杀特性的初步研究

以K_2型嗜杀酵母为材料在改进Russell(1986)的嗜杀活性检测方法基础上,建立了双层平板单菌落检测法。此法可直接用于嗜杀酵母的筛选,嗜杀质粒的检测,并能在诱变后的平板上检出有嗜杀活性的营养缺陷型菌株MK_2-3:K^+,len。对K_2嗜杀特性初步研究表明,K_2型嗜杀酵母能杀死酿酒酵母(Saccha-romyces cerevisiae),但对所测汉逊酵母(Hansenula spp.)无作用。嗜杀毒素产生的最适pH和温度分别为pH4.5—5.5和20—25℃,酵母菌的对数生长期嗜杀毒素达到高峰。用紫外线(UV)、溴化乙锭(EB)、亚硝基胍(NTG)和甲基磺酸乙酯(EMS)进行消除K因子实验,表明亚硝基胍和紫外线对K因子具有一定消除率,而溴化乙锭和甲基磺酸乙酯未发现消除作用。

酵母嗜杀质粒融合转移──Ⅰ．融合转移系统的建立

以嗜杀酵母ＥＲＲ１和啤酒生产酵母ＡＳ２４２０出发菌株，建立了供体菌ＭＫ２－３：Ｋ＋Ｒ＋Ｌｅｕ－ρ＋（ｎ）和受体菌ＡＳ２４２０－１：Ｋ－Ｒ－ｌｅｕ＋ρ°（２ｎ）．对原生质体制备再生条件的研究结果表明两株菌的原生质体制备条件不尽相同；同一菌株原生质体形成与再生的最佳条件也不相同．有利于融合再生的原生质体制备条件是ＭＫ２－３：菌龄３０ｈ，蜗牛酶解量３０ｇ／Ｌ酶解时间３０ｍｉｎ，此时原生质体形成率为８０％，而再生率达１７．１％，这些条件对嗜杀活性无影响，再生菌落的嗜杀活性率达１００％；而ＡＳ２４２０－１；菌龄２４ｈ，蜗牛酶量２０ｇ／Ｌ，酶解时间３０ｍｉｎ，原生质体形成率为８１％，再生率为１８．１％．对四种渗透压稳定剂的再生效果实验表明甘露醇效果最佳，氯化钾次之，考虑到廉价，氯化钾是很好的代用品，在３０％ＰＥＧ６０００及Ｃａ２＋条件下进行原生质体融合，融合率可达８．９×１０－６，对其中的融合子ＭＡＲ４的遗传性状及嗜杀活性的稳定性检测，ＤＮＡ含量及细胞大小测定，ｄｓＲＮＡ质粒的提取及电泳结果分析和发酵性能测定，结果表明融合子ＭＡＲ４具有较高的嗜杀活性并可以稳定遗传，有与供体菌ＭＫ２－３嗜杀质粒ｄｓＲＮＡ相同的电泳行为，?

嗜杀苹果酒酵母的构建

采用核融合缺陷原生质体融合技术 ,将嗜杀质粒供体菌 5 0 45 (α ,his4,kar1— 1[KIL—K1 ]rho+ )中的嗜杀质粒转移到受体菌苹果酒酵母AW中去。用 3 5 %PEG ,3 0℃诱导融合 2 0min ,经嗜杀活性检出、小型酿造实验、遗传稳定性实验、细胞大小及体积的测定、dsRNA质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳等实验 ,筛选出 4株遗传性状稳定、具有嗜杀活性且发酵性能良好的融合子F12、F3 0、F5 7、F65。

嗜杀酵母的生物学功能及其应用

嗜杀酵母能够分泌毒素蛋白,杀死敏感酵母。嗜杀酵母对自身分泌的嗜杀毒素具有免疫力。嗜杀酵母的嗜杀特性与两种双链线状RNA(dsRNA)有关,即编码产生毒素蛋白的M-dsRNA和编码自身和M-dsRNA外壳蛋白的L-dsRNA。嗜杀毒素破坏细胞跨膜化学质子梯度,造成ATP和钾离子泄漏,导致细胞死亡。应用嗜杀酵母可避免野生型酵母污染,净化发酵体系,改善发酵产物品质;嗜杀毒素也可作为抵制病原酵母和类酵母微生物的抗真菌剂。

酿酒酵母两种不同嗜杀菌株的比较研究

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株SK4（K1型）和ERRI（K2型）为材料，分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性，两株嗜杀酵母具有相互杀死作用，其嗜杀活性与菌体生长有关。SK4和ERRI的嗜杀质粒的比较表明：M1－dsRNA质粒和M2-dsRNA质粒分子量分别为1．7kb和1．5kb，两株菌的L－dsRNA质粒均为4．0kb。用高温和紫外线处理嗜杀酵母，嗜杀活性随之消失，消除菌中的M－dsRNA质粒也相应消失，嗜杀活性的消除率随菌株和消除剂的不同而变化。实验证明两株菌产生的毒素蛋白的最适嗜杀作用条件不同，最适pH和温度分别为4．8、16℃和4．0、22℃，但两种毒素蛋白均对在对数生长期的敏感细胞作用最显著。

酿酒酵母不同嗜杀菌株的比较及相互作用

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株ＳＫ４（Ｋ１型）和ＥＲＲ１（Ｋ２型）为材料，分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性．证明两株菌产生的毒素蛋白的最适条件不同，最适ｐＨ和温度分别为４．８、１６℃和４．２、２２℃，但均对在对数生长期的敏感细胞作用最显著．ＳＫ４和ＥＲＲ１的嗜杀质粒的比较表明：Ｍ１－ｄｓＲＮＡ质粒和Ｍ２－ｄｓＲＮＡ质粒分子量分别为１．７ｋｂ和１．５ｋｂ，两株菌的Ｌ－ｄｓＲＮＡ质粒均为４．０ｋｂ．用高温和紫外线处理嗜杀酵母，嗜杀活性随之消失．