美洲鲥鱼嗜水气单胞菌病原的分离与鉴定

2021年,山东省临沂市一养殖场养殖的美洲鲥鱼(Alosa sapidissima)突发疾病并出现严重死亡,日死亡率高峰期达到2.5%,累积死亡率约为90%。患病鱼主要症状为体表出血、溃疡,解剖可见腹腔腹水、肝脏暗红,并伴有肠炎。组织病理学检测发现,病鱼肝脏出现弥散性坏死,嗜碱性粒细胞增多和细胞肿胀空泡变性;脾脏出现出血性贫血性坏死灶、核破裂和核固缩;肾脏淋巴细胞坏死脱落,肾小体毛细血管球萎缩,近端小管和远端小管内的细胞出现不同程度的细胞结构消失。发病鱼肉眼和显微镜观察未见明显寄生虫,利用PCR方法检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2)、鲈鱼蛙病毒(largemouth bass ranavirus)等淡水鱼类常见病毒均为阴性。细菌分离培养结果显示,从发病鱼的肝脏、肾脏和脾脏中分离得到形态一致的优势菌,命名为AS-AH2101。经16S rRNA测序比对和生理生化鉴定,确定AS-AH2101为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。毒力基因检测结果显示,AS-AH2101携带气溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、丝氨酸蛋白酶(ahpA)、热稳定细胞肠毒素(ast)、热敏感细胞肠毒素(altA)和密度感应系统(luxS)基因。人工感染实验结果显示,AS-AH2101能引起蓝曼龙(Trichogaster trichopterus)发病死亡,半数致死量为3.23×10^(4)CFU/尾。药物敏感性研究表明,AS-AH2101对头孢拉啶、阿莫西林、氨苄西林和红霉素等4种抗生素具有耐药性,对四环素和多西环素等11种抗生素敏感。综上所述,本研究报道了我国养殖美洲鲥鱼感染嗜水气单胞菌的典型病例,为美洲鲥鱼在我国养殖过程中的疾病防控以及嗜水气单胞菌病的防治提供了参考和借鉴。

七彩神仙鱼BTN1A1基因克隆及其在嗜水气单胞菌胁迫下的表达分析

【目的】克隆七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)嗜乳脂蛋白1A1(Butyrophilin 1A1,BTN1A1)基因,分析其在病原刺激下的表达模式,为了解七彩神仙鱼BTN1A1基因功能提供依据。【方法】利用生物信息学对七彩神仙鱼2个BTN1A1基因(BTN1A1-1和BTN1A1-2)进行结构和进化分析。根据前期获得的七彩神仙鱼皮肤转录组数据,选取BTN1A1-1和BTN1A1-2基因的CDS区设计引物进行克隆。采用qRT-PCR分析BTN1A1在各组织中的表达及嗜水气单胞菌刺激下的表达模式。【结果】BTN1A1-1和BTN1A1-2的ORF序列长度为894、1275 bp,分别编码298、424个氨基酸。BTN1A1-1和BTN1A1-2蛋白均具有1个信号肽、1个Ig结构域、1个lg_like结构域和1个跨膜结构域的经典结构,BTN1A1-2还具有1个胞质结构域。七彩神仙鱼BTN1A1-1与慈鲷科其他鱼类相似性较高,与尼加拉瓜湖始丽鱼(Archocentrus centrarchus)BTNIAI对应氨基酸序列同源性最高、为94.14%。但BTN1A1-2与其他鱼类发生分离,形成独特分支。BTN1A1-1和BTN1A1-2在七彩神仙鱼各组织中均有表达,但在鳃、肠道、皮肤等与免疫相关的组织中表达量相对较高。七彩神仙鱼BTN1A1-1在嗜水气单胞菌胁迫后表达量先显著下降后上升,而BTN1A1-2表达量则先显著上升后下降。【结论】七彩神仙鱼BTN1A1-1基因相对保守,而BTN1A1-2基因在进化上较为特殊。二者在免疫刺激下的差异表达暗示其可能在七彩神仙鱼免疫防御中发生功能分化。

茶多酚对嗜水气单胞菌致病力的抑制作用

针对嗜水气单胞菌污染水产品所致动物感染和消费者食源性疾病等问题,筛选能够抑制嗜水气单胞菌致病力的天然产物茶多酚。溶血试验表明茶多酚对气溶素溶血活性具有直接抑制作用,通过荧光热漂移和七聚体形成试验分析其作用机制。结果表明,茶多酚虽在128μg/mL以下不抑制嗜水气单胞菌的生长,但能在1~8μg/mL直接抑制其主要毒力蛋白气溶素的溶血活性。荧光热漂移和七聚体试验发现,茶多酚通过与气溶素直接结合,降低了气溶素七聚体的形成并抑制其活性。细胞试验结果表明,4~8μg/mL茶多酚能对气溶素导致的人肺癌上皮细胞死亡具有显著的保护作用。此外,50 mg/kg茶多酚治疗可使斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型的存活率提高至60%。综上,茶多酚通过直接与气溶素结合,抑制气溶素形成功能性七聚体而降低其活性,从而显著降低嗜水气单胞菌的体内、外致病力。研究结果提示茶多酚可作为抗生素替代或辅助药物用于治疗嗜水气单胞菌相关感染。

嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB的原核表达及生物信息学分析

为筛选TolB作为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)渔用疫苗候选抗原,从嗜水气单胞菌中克隆了外膜蛋白tolB基因并异源表达,采用生物信息学方法预测TolB的理化性质和结构特征。结果显示,tolB基因片段(去除信号肽)全长1 263 bp,编码1条含有420个氨基酸残基的多肽,分子质量45.78 ku。成功在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中异源表达TolB蛋白,其为稳定的亲水性外膜蛋白。TolB蛋白家族在不同菌株间具有同源性,尤其在气单胞菌间亲缘关系更近。TolB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,具有潜在的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和辅助T细胞(Th)抗原表位;相互作用网络主要为TolPal系统蛋白。综上,TolB具有成为嗜水气单胞菌亚单位疫苗有效候选抗原的特性。

嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法的建立

文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)的方法进行反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。实验结果表明,所建立的嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法可在38℃最适温度下30min内无干扰地检测到嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限为10^(3)cfu/mL和100 pg/μL。利用建立的RPA-LFD与普通PCR同时检测杂交鲟鱼处理临床样品的结果表明,两种方法的结果一致。综上所述,通过对RPA反应条件的探索和优化,成功建立了嗜水气单胞菌快速检测方法。该方法操作简便,反应迅速,与普通PCR相比,不需要昂贵的仪器,为未来嗜水气单胞菌细菌性疾病的早期诊断提供了更有效的技术支持。

鳜鱼源嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

为了确定某养鱼场鳜鱼病死原因和制定治疗方案,将采集的病死鳜鱼鳃和肝脏涂布于LB培养基分离纯化细菌、革兰氏染色和涂布鉴别培养基,并通过聚合酶链式反应方法确定病原体。通过动物回归实验评价菌株致病性;最后通过药敏试验筛选敏感药物。结果显示,病原菌经革兰氏染色后呈红色短杆状;在麦康凯培养基上呈白色菌落,RS培养基上呈黄色菌落;聚合酶链式反应鉴定该菌为嗜水气单胞菌。药敏试验表明该菌株对头孢曲松、头孢哌酮等药物敏感。本研究结果可为嗜水气单胞菌的防控及制定其引起的鱼类病症治疗方案提供参考。

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起斑马鱼肠道生理损伤和肠道菌群失调

研究分析了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染斑马鱼后肠道生理健康和肠道微生物的变化。以斑马鱼为研究对象,刮伤皮下真皮,使用10^(5)CFU/mL浓度的嗜水气单胞菌暴露6 h后转入清水,分别在暴露前、暴露后6 h、12 h、24 h取样。使用鱼特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒,检测肠道中紧密连接蛋白ZO-2(TJP2)含量和乙氧基异戊二烯-O-脱乙基酶(EROD)酶活性,结果表明,嗜水气单胞菌暴露引起了斑马鱼肠道生理损伤,表现为肠道TJP2含量、EROD酶活性在暴露后显著下调。采用16S rRNA高通量测序检测肠道微生物及其菌群结构变化,嗜水气单胞菌暴露斑马鱼后致病菌不动杆菌属(Acinetobacter)明显增加,OTUs数量明显下降,Alpha多样性降低,结果说明嗜水气单胞菌引起了斑马鱼肠道菌群失调。肠道中微生物的多样性与改善肠道上皮和黏膜屏障功能紧密相关,该研究对从肠道健康的角度评价嗜水气单胞菌毒性,探索嗜水气单胞菌的致病机制具有重要意义。

嗜水气单胞菌RND外排泵中药抑制剂的筛选

随着抗生素的滥用,抗菌药物耐药性(Antimicrobial resistance,AMR)已经成为重大公共卫生问题。研究表明革兰氏阴性菌中普遍存在的RND (Resistance Nodulation Division)外排泵在细菌多重耐药机制中扮演了关键角色。RND外排泵抑制剂(efflux pump inhibitors, EPIs)可以将大大降低细菌的耐药性。化学药物类抑制剂虽然抑制效果好,但副作用大,限制了其在临床和水产养殖业上的应用。已证实多种植物及其成分有抑制细菌产生耐药性和消除耐药性等作用,因此中草药成为筛选外排泵抑制剂的巨大宝库。本研究选用了利血平、N-甲基吡咯烷酮、板蓝根、黄芪、连翘、黄连等中药作为抑制嗜水气单胞菌耐药性的候选药物,结果表明利血平的抑菌效果和抑制耐药性的效果最显著,黄连次之。联合药物作用实验结果显示,利血平和OXY在2.5 μg/mL和10 μg/mL的作用下抑菌效果显著。Western blotting结果显示,RND外排泵中的AcrA蛋白的表达量随着利血平浓度的上升而下降,推测说明利血平可能是通过抑制AcrA蛋白的表达来抑制外排泵的外排效率,从而降低嗜水气单胞菌的耐药性。本研究为中药抗生素联合制剂在临床和水产养殖上的应用提供分子基础,为解决细菌耐药性提供理论依据和参考。

三角帆蚌CypA基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染后的表达分析

为研究亲环蛋白A(Cyclophilin A,CypA)在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)免疫系统中的作用,研究利用PCR与RACE技术克隆获得三角帆蚌CypA基因全长cDNA序列(基因序列登录号:MN121742)。三角帆蚌CypA基因cDNA序列全长1237 bp,其5′非编码区(UTR)长度为57 bp,3′非编码区长度为688 bp,三角帆蚌CypA基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长度为492 bp,编码164个氨基酸,CypA蛋白质理论等电点为8.9,相对分子量为17.29 kD。在GenBank中进行同源序列检索,三角帆蚌CypA氨基酸序列与其他贝类CypA的相似性依次为池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)(99.39%)、青蛤(Cyclina sinensis)(77.44%)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)(78.05%)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)(78.66%)和大竹蛏(Solen grandis)(75.05%)。通过SWISS-MODEL预测三角帆蚌CypA含有8个β折叠和2个α螺旋,可能形成CypA的活性中心区域。利用MEGA 5.1软件将三角帆蚌CypA与其他物种CypA基因进行序列比对并构建系统进化树,分析发现三角帆蚌CypA与池蝶蚌的CypA聚为一支,其与池蝶蚌CypA具有最近的亲源关系。通过qRT-PCR检测CypA基因在三角帆蚌不同组织中表达,发现三角帆蚌性腺中CypA基因的表达量最高,肝脏、肾和鳃中的表达量次之。对三角帆蚌浸泡感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),CypA基因在肝脏、性腺、肠和鳃中的表达水平在感染72h先升高后降低,其表达量在性腺和鳃中6h最高,肝脏中12h达到峰值,肠中24h达到最高值,表明三角帆蚌感染嗜水气单胞菌后,可显著诱导CypA基因的表达。CypA基因在性腺中的表达量到达峰值的时间要早于肠与肝脏,且到达峰值时的相对表达量(14.91)也显著高于肝脏(9.89)、肠(9.78)和鳃(7.53),推测CypA在三角帆蚌性腺中具有防御细菌感染的重要作用,三角帆蚌性腺可能不仅具有生殖的功能,同时在免疫防御系统中也发挥着重要的作用。

鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

中草药防治嗜水气单胞菌相关疾病研究进展

嗜水气单胞菌作为水产养殖业中危害最大的、最常见的条件致病菌,严重威胁着水产养殖业的经济发展。当前防治嗜水气单胞菌的主要手段依然是抗生素,但大量抗生素的滥用导致水产养殖业中常见病原菌的耐药日趋严重。因此迫切需要绿色、安全的抗生素替代物防治嗜水气单胞菌的同时缓解耐药。中草药富含丰富的活性物质,具有良好的抗菌性和无抗药性,一直是抗生素替代物的热门选择,在防治嗜水气单胞菌相关疾病中拥有良好的应用前景。笔者综述了中草药防治嗜水气单胞菌相关疾病的抑菌机制、对细菌结构和耐药性的影响以及提高机体免疫力的作用机理,同时总结了大黄、芦荟、黄岑、厚朴、姜黄等常见单味药和复方制剂以及中西结合治疗在防治嗜水气单胞菌相关疾病中的应用情况,为中草药防治嗜水气单胞菌相关疾病的应用发展提供一定的参考。

致病性嗜水气单胞菌耐受性及其相关蛋白HSP60的分离与鉴定

[目的]为了了解致病性嗜水气单胞菌的耐受性调控机制。[方法]根据GBT18652—2002《致病性嗜水气单胞菌检验方法》从病鱼病灶上分离获得致病性嗜水气单胞菌,进行耐盐、耐酸碱、耐药性试验及不同环境影响下该菌的菌体蛋白提取,并对差异蛋白进行质谱鉴定。[结果]该致病性嗜水气单胞菌在35‰盐度和pH=6的环境下增长快;对喹诺酮类药物最为敏感,对磺胺类和氯霉素类抗生素具有耐药性;对35~73ku处有明显变化的条带进行蛋白分离,质谱鉴定为HSP60。[结论]该菌的HSP60蛋白受盐度和酸碱度影响,参与耐受性调控。

嗜水气单胞菌致脓毒血症的救治研究

嗜水气单胞菌是一种分布于自然界各种水体中的革兰阴性杆菌,28℃~ 30.0℃为最适繁殖温度,普遍存在于盐量较低的河水、湖水、海水、游泳池、下水道等环境中的条件致病菌,可感染多种水生物和其他动物,是人兽鱼共患的条件致病菌。本研究对象为人类感染嗜水气单胞菌引起的脓毒血症,通过临床案例分析,总结救治体会。方法 本文选取了8例由嗜水气单胞菌引起的脓毒血症患者作为研究对象,将详细介绍救治过程、方法及效果。结果 结果表明,早期诊断、及时治疗和合理使用抗生素是救治的关键。针对嗜水气单胞菌致脓毒血症死亡救治方案,仍存在一些问题需要进一步探讨。结论 全面掌握嗜水气单胞菌感染的诊断要点、急救措施、预防感染扩散、药物治疗、患者护理、心理疏导、病情监测以及康复指导等方面的知识。并将其应用到实际救治过程中才能有效提高救治成功率并减少并发症的发生率。为临床医生提供参考和借鉴。

三黄散对嗜水气单胞菌的治疗作用研究

为研究三黄散对嗜水气单胞菌引起的鱼病的治疗作用,采用水煮方法提取三黄散有效成分后调整有效浓度为1g/mL后,采用背部肌肉注射感染的方法注射菌液浓度为1×10^(7)CFU/mL的嗜水气单胞菌。结果显示,未感染的对照组存活率为100%;未投放三黄散实验组共死亡51尾,死亡率达85%(51/60);三黄散全池泼洒实验组共死亡17尾,死亡率为28.3%(17/60);三黄散拌料投喂实验组,共死亡19尾,死亡率为31.7%(19/60);全池泼洒三黄散的同时拌饵料投喂的实验组,共死亡13尾,死亡率为21.7%(13/60)。证明三黄散对治疗嗜水气单胞菌是切实有效的,可为临床治疗提供一定的参考作用。

大黄素对嗜水气单胞菌的抑菌作用及其机制

为了探究大黄素对嗜水气单胞菌的体外抑菌作用及其机制,本试验采用二倍稀释法检测大黄素最低抑菌浓度(MIC)及其对试验菌生长曲线的影响;检测培养液中碱性磷酸酶(AKP)活性,以分析大黄素对试验菌细胞壁通透性的影响;检测β-D-半乳糖苷酶活性和DNA含量,以探究大黄素对试验菌细胞膜通透性的影响;采用结晶紫染色法检测大黄素对试验菌生物膜形成的影响;检测大黄素对外毒素溶血活性和内毒素分泌量的影响及其对感染鲫鱼的保护作用。结果显示,大黄素MIC为32μg/mL,可明显抑制嗜水气单胞菌生长。与二甲亚砜(DMSO)对照相比,大黄素浓度≥32μg/mL时,培养液中AKP活性、β-D-半乳糖苷酶活性和DNA含量均显著升高(P<0.05);大黄素浓度为4~16μg/mL时,生物膜形成量显著降低(P<0.05);大黄素浓度为32~128μg/mL时,培养液中外毒素的溶血百分比为(36.97±3.60)%~(75.15±7.29)%(P<0.05),内毒素的分泌量无显著变化(P>0.05)。鲫鱼注射大黄素[≥64 mg/(kg·bw)]后感染嗜水气单胞菌(2×10~6CFU/尾),72 h存活率(50%~60%)高于未注射大黄素的感染鱼(0)。结果表明,大黄素通过破坏嗜水气单胞菌细胞壁完整性、增加细胞膜通透性发挥抑菌作用,还可抑制其生物膜形成和外毒素的溶血活性,提高感染模型的抗病力,有望进一步开发为新型抗菌药替代品。

5种中药提取物及其组合对嗜水气单胞菌的体外抑制作用

试验旨在探讨大黄、诃子、五倍子、黄连、黄芩5种中药及其组合对嗜水气单胞菌的体外抑制作用。试验测定了5种中药的水提物和醇提物对3株嗜水气单胞菌的抑菌圈、最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)及对嗜水气单胞菌生长的影响,采用棋盘交叉法测定了5种中药联合抑菌作用。结果显示,大黄和黄芩醇提物的抑菌圈显著高于其水提物(P<0.05),诃子和黄连水提物的抑菌圈显著高于其醇提物(P<0.05),五倍子水提物和醇提物抑菌圈大小相近。五倍子抗菌作用最强,其水提物和醇提物MIC为7.81~15.63 g/L,大黄醇提物和诃子水提物抗菌作用次之,MIC均为15.63~31.25 g/L。选择抑菌作用更强的提取物两两组合,五倍子水提物与其他4种中药提取物组合、大黄醇提物与黄连水提物组合均为协同作用;黄连水提物与黄芩醇提物组合为相加作用;大黄醇提物与黄芩醇提物、诃子水提物与黄连水提物组合均为无关作用;诃子水提物与黄芩醇提物组合为拮抗作用。研究表明,5种中药对嗜水气单胞菌均具有抑制作用,五倍子作用最强,五倍子水提物与其他4种中药提取物两两组合、黄连水提物与黄芩醇提物组合均可增强抗菌活性。

四株鳖源致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的表型、分子鉴定及其毒力基因检测

采用生态毒理学、表观分类学及分子生物学方法,对具白底板病典型症状濒死中华鳖内脏中分离获得的4株病原菌开展了以致病性、表型分析、分子鉴定及毒力基因检测为内容的实验研究,结果表明:(1)4株病原菌均具致病性,致死力由大到小依次为ZHYYZ-2、ZHYYZ-4、ZHYYZ-1、ZHYYZ-3;(2)4株病原菌均为呈短杆状、具溶血活性的革兰氏阴性细菌,VITEK2型全自动细菌鉴定与药敏系统和ATBExpression型细菌鉴定与药敏智能系统均显示为嗜水气单胞菌;(3)ZHYYZ-1、ZHYYZ-2、ZHYYZ-3、ZHYYZ-4的16SrDNA序列长度分别为1460、1464、1466、1461,经Blast同源性检索表明它们所扩增的16SrDNA序列与GenBank数据库中登记的71株嗜水气单胞菌的相似性均为99%;(4)经PCR特异性检测,各实验菌均含有Aha、AHH、AerA和OMP。根据4株实验菌的表型和分子生物学特征,判定它们均为气单胞菌属的致病性嗜水气单胞菌。

丁酸钠对嗜水气单胞菌生长及毒力的影响

【目的】探究丁酸钠对嗜水气单胞菌生长和毒力的影响,评估丁酸钠对嗜水气单胞菌的抑菌活性,并探索其作用机制。【方法】通过微量肉汤稀释法测定丁酸钠对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC),采用泳动和集群运动试验检测丁酸钠对嗜水气单胞菌的运动状态的影响,使用酶活性和溶血性试验检测丁酸钠对嗜水气单胞菌的脂肪酶、蛋白酶和溶血性的影响,生物膜试验检测丁酸钠对嗜水气单胞菌生物膜的抑制作用,实时荧光定量PCR技术检测丁酸钠对嗜水气单胞菌毒力和群体感应系统的相关基因表达的影响。【结果】丁酸钠对3株嗜水气单胞菌的MIC均>512 mg/L;丁酸钠浓度≤512 mg/L时,不影响3株嗜水气单胞菌的生长。当丁酸钠浓度≥64 mg/L时,除对GZ-SS2019的集群运动能力无显著影响(P>0.05)外,均能显著抑制3株嗜水气单胞菌的运动能力(P<0.05),此浓度下还显著抑制3株嗜水气单胞菌生物膜的形成(P<0.05)。在丁酸钠浓度为128 mg/L时,对3株嗜水气单胞菌脂肪酶活性无显著影响(P>0.05),却显著抑制3株嗜水气单胞菌蛋白酶活性(P<0.05);而丁酸钠浓度≥32 mg/L时,除对GZDX-01的抑制效果不显著(P>0.05)外,能显著降低其余2株嗜水气单胞菌溶血率(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,丁酸钠浓度≥128 mg/L时能显著降低群体感应系统luxS和ahyR基因表达量(P<0.05);溶血相关基因aerA表达量显著下降(P<0.05),此外ompW、ompA、fur基因表达量也显著下降(P<0.05)。【结论】丁酸钠浓度≤512 mg/L时不影响嗜水气单胞菌的生长,但能有效干扰嗜水气单胞菌的运动状态、酶活性、溶血性及生物膜的形成,以及毒力基因和群体感应系统相关基因的表达,其中丁酸钠浓度≥128 mg/L时效果较好。

循环水养殖系统中高毒力嗜水气单胞菌的鉴定与药敏试验

为探究中华鳖(Pelodiscus sinensis)循环水养殖过程中出现体表穿孔和溃疡的病因,对患病中华鳖的肝、脾、肺和肾等部位取样并进行病原菌分离及革兰氏染色,利用16S rRNA测序和生化鉴定相结合进行细菌鉴定,通过毒力基因PCR检测和人工回感试验评估细菌的致病性,以纸片扩散法评估几种抗生素的抑菌效果,利用琼脂打孔法评估中药提取物的抑菌效果。结果显示,从病鳖的脏器中分离到一株优势菌AH0421,该菌为革兰氏阴性菌,菌体呈短杆状;菌株AH0421与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)模式菌株ATCC 7966的16S r RNA序列相似性高达99.66%。菌株AH0421能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖,具有O/129耐受性,其携带act、aerA、aha、ahh、ahp、ahpA、alt、ast、hlyA、lip、ompA毒力基因。回感试验出现与自然发病相似病症,菌株AH0421半致死浓度(LC_(50))为1.7×10^(6)CFU/mL。中药五味子提取物、诺氟沙星、多西环素、恩诺沙星、新霉素以及头孢克肟、头孢曲松等头孢类抗生素对该菌有较强的抑制作用。研究表明,五味子和多数头孢类抗生素可作为治疗菌株AH0421感染的参考药物。

SELEX筛选嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)适体方法的建立

嗜水气单胞菌是水产养殖中一种比较常见的致病病原菌。本研究以嗜水气单胞菌为研究对象,利用SELEX指数富集系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX),经过12轮的筛选,通过生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与嗜水气单胞菌的亲和力,克隆、测序后,用DNAMAN软件分析其一级序列与二级结构。研究结果表明,通过12轮筛选后,亲和力由最初的0.32升到第9轮的0.72,亲和力提高了2.25倍。一级结构主要由GT组成,说明同源性适体有了一定程度的富集。二级结构模拟图以茎环状结构为主,说明这些茎环状结构可能是适体与靶分子进行结合作用的基础,也是其进一步形成三维空间结构的基础。