一例鲈鱼弹状病毒、柱状黄杆菌和嗜水气单胞菌混合感染的诊治

2023年10月末沈阳市一鲈鱼养殖场新进鲈鱼苗发病,临床主要以烂鳃、烂身、烂尾为主要症状,经流行病学调查结合剖检、实验室检测,最终确诊此次发病主要为弹状病毒感染继发柱状黄杆菌和嗜水气单胞菌混合感染引起,并对该场给出了防治建议。

斑鳜肠道组织对嗜水气单胞菌感染早期的免疫响应

【目的】嗜水气单胞菌是危害斑鳜养殖生产的主要病原之一。研究斑鳜感染嗜水气单胞菌后,其肠道组织基因表达水平的变化,解析鱼体对细菌性感染的免疫应答分子机制,为防控淡水鱼类细菌性疾病提供依据。【方法】用嗜水气单胞菌感染斑鳜6 h后,利用Illumina Hiseq 6000测序平台对斑鳜肠道组织进行RNA-seq测序,并利用生物信息学方法对数据进行分析。【结果】感染组和未感染组斑鳜肠道组织存在1077个差异表达基因(DEGs),包括669个上调DEGs和408个下调DEGs。其中,与免疫相关的上调DEGs主要有基质金属蛋白酶3(MMP3)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-17F(IL-17F)、正五聚蛋白3(PTX3)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)含pyrin结构域蛋白6(NLRP6)、C型凝集素域家族4E(CLEC4E)、胆固醇-25-羟化酶(CH25H)和激活转录因子1(ATF1)等。基因本体(GO)富集分析显示,DEGs主要富集在免疫反应激活信号通路、免疫应答调节细胞表面受体信号通路、T细胞活化的正调控过程以及细胞修复和调节过程上。京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析显示,上调DEGs主要富集在多种疾病发生、发展过程和免疫代谢相关信号通路上。实时荧光定量PCR验证结果表明,7个随机选取的与免疫相关的DEGs的表达量与RNA-seq测序结果存在一致性。【结论】感染组与未感染组斑鳜肠道组织MMP3、IL-1β、PTX3、NLRP6、CLEC4E表达量的差异较为显著,可能是参与斑鳜肠炎发生的关键候选基因。

七彩神仙鱼BTN1A1基因克隆及其在嗜水气单胞菌胁迫下的表达分析

【目的】克隆七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)嗜乳脂蛋白1A1(Butyrophilin 1A1,BTN1A1)基因,分析其在病原刺激下的表达模式,为了解七彩神仙鱼BTN1A1基因功能提供依据。【方法】利用生物信息学对七彩神仙鱼2个BTN1A1基因(BTN1A1-1和BTN1A1-2)进行结构和进化分析。根据前期获得的七彩神仙鱼皮肤转录组数据,选取BTN1A1-1和BTN1A1-2基因的CDS区设计引物进行克隆。采用qRT-PCR分析BTN1A1在各组织中的表达及嗜水气单胞菌刺激下的表达模式。【结果】BTN1A1-1和BTN1A1-2的ORF序列长度为894、1275 bp,分别编码298、424个氨基酸。BTN1A1-1和BTN1A1-2蛋白均具有1个信号肽、1个Ig结构域、1个lg_like结构域和1个跨膜结构域的经典结构,BTN1A1-2还具有1个胞质结构域。七彩神仙鱼BTN1A1-1与慈鲷科其他鱼类相似性较高,与尼加拉瓜湖始丽鱼(Archocentrus centrarchus)BTNIAI对应氨基酸序列同源性最高、为94.14%。但BTN1A1-2与其他鱼类发生分离,形成独特分支。BTN1A1-1和BTN1A1-2在七彩神仙鱼各组织中均有表达,但在鳃、肠道、皮肤等与免疫相关的组织中表达量相对较高。七彩神仙鱼BTN1A1-1在嗜水气单胞菌胁迫后表达量先显著下降后上升,而BTN1A1-2表达量则先显著上升后下降。【结论】七彩神仙鱼BTN1A1-1基因相对保守,而BTN1A1-2基因在进化上较为特殊。二者在免疫刺激下的差异表达暗示其可能在七彩神仙鱼免疫防御中发生功能分化。

茶多酚对嗜水气单胞菌致病力的抑制作用

针对嗜水气单胞菌污染水产品所致动物感染和消费者食源性疾病等问题,筛选能够抑制嗜水气单胞菌致病力的天然产物茶多酚。溶血试验表明茶多酚对气溶素溶血活性具有直接抑制作用,通过荧光热漂移和七聚体形成试验分析其作用机制。结果表明,茶多酚虽在128μg/mL以下不抑制嗜水气单胞菌的生长,但能在1~8μg/mL直接抑制其主要毒力蛋白气溶素的溶血活性。荧光热漂移和七聚体试验发现,茶多酚通过与气溶素直接结合,降低了气溶素七聚体的形成并抑制其活性。细胞试验结果表明,4~8μg/mL茶多酚能对气溶素导致的人肺癌上皮细胞死亡具有显著的保护作用。此外,50 mg/kg茶多酚治疗可使斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型的存活率提高至60%。综上,茶多酚通过直接与气溶素结合,抑制气溶素形成功能性七聚体而降低其活性,从而显著降低嗜水气单胞菌的体内、外致病力。研究结果提示茶多酚可作为抗生素替代或辅助药物用于治疗嗜水气单胞菌相关感染。

嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法的建立

文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)的方法进行反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。实验结果表明,所建立的嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法可在38℃最适温度下30min内无干扰地检测到嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限为10^(3)cfu/mL和100 pg/μL。利用建立的RPA-LFD与普通PCR同时检测杂交鲟鱼处理临床样品的结果表明,两种方法的结果一致。综上所述,通过对RPA反应条件的探索和优化,成功建立了嗜水气单胞菌快速检测方法。该方法操作简便,反应迅速,与普通PCR相比,不需要昂贵的仪器,为未来嗜水气单胞菌细菌性疾病的早期诊断提供了更有效的技术支持。

嗜水气单胞菌相关毒力因子的研究进展

嗜水气单胞菌是一种人-兽-鱼共患的革兰氏阴性菌,可导致水生动物患有出血性败血症等疾病,其毒力因子在感染动物机体过程(包括黏附、定植及损伤宿主细胞)中起重要作用,主要包括黏附因子、分泌性蛋白、分泌系统、群体感应系统和金属摄取系统。文章综述了上述五类嗜水气单胞菌感染相关毒力因子的研究进展,旨在为深入了解该菌的致病机制提供理论依据。

美洲鲥鱼嗜水气单胞菌病原的分离与鉴定

2021年,山东省临沂市一养殖场养殖的美洲鲥鱼(Alosa sapidissima)突发疾病并出现严重死亡,日死亡率高峰期达到2.5%,累积死亡率约为90%。患病鱼主要症状为体表出血、溃疡,解剖可见腹腔腹水、肝脏暗红,并伴有肠炎。组织病理学检测发现,病鱼肝脏出现弥散性坏死,嗜碱性粒细胞增多和细胞肿胀空泡变性;脾脏出现出血性贫血性坏死灶、核破裂和核固缩;肾脏淋巴细胞坏死脱落,肾小体毛细血管球萎缩,近端小管和远端小管内的细胞出现不同程度的细胞结构消失。发病鱼肉眼和显微镜观察未见明显寄生虫,利用PCR方法检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2)、鲈鱼蛙病毒(largemouth bass ranavirus)等淡水鱼类常见病毒均为阴性。细菌分离培养结果显示,从发病鱼的肝脏、肾脏和脾脏中分离得到形态一致的优势菌,命名为AS-AH2101。经16S rRNA测序比对和生理生化鉴定,确定AS-AH2101为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。毒力基因检测结果显示,AS-AH2101携带气溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、丝氨酸蛋白酶(ahpA)、热稳定细胞肠毒素(ast)、热敏感细胞肠毒素(altA)和密度感应系统(luxS)基因。人工感染实验结果显示,AS-AH2101能引起蓝曼龙(Trichogaster trichopterus)发病死亡,半数致死量为3.23×10^(4)CFU/尾。药物敏感性研究表明,AS-AH2101对头孢拉啶、阿莫西林、氨苄西林和红霉素等4种抗生素具有耐药性,对四环素和多西环素等11种抗生素敏感。综上所述,本研究报道了我国养殖美洲鲥鱼感染嗜水气单胞菌的典型病例,为美洲鲥鱼在我国养殖过程中的疾病防控以及嗜水气单胞菌病的防治提供了参考和借鉴。

嗜水气单胞菌感染大口黑鲈肠炎模型的建立及评价

【目的】采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染建立稳定大口黑鲈(Micropterus salmoides)的细菌性肠炎模型,并确定导致肠炎发生的细菌浓度和作用时间。【方法】150尾健康的大口黑鲈随机分为5组:对照组和4个试验组(感染浓度分别为1×10^(8)、1×10^(7)、1×10^(6)和1×10^(5) CFU/mL),通过腹腔注射方式进行人工感染。通过临床症状、剖检病变及评分、组织学变化及评分、肠道组织超微结构变化和炎症因子基因表达量评价各试验组造模效果。【结果】攻毒后试验组表现出游动慢,摄食下降的现象,且在攻毒第2和第3天时,1×10^(8) CFU/mL攻毒组有死亡现象。剖检后可见肛门红肿、外突,腹鳍和腹部皮肤出血等症状,肠道充血、出血,部分可见肠液潴留等。各组大体病理得分与细菌的感染浓度呈正相关,与感染时间呈负相关。组织学观察可见肠道固有层充血、水肿、增厚,并伴有炎性细胞浸润,黏膜上皮损伤脱落、细胞变性、坏死、增生,杯状细胞数目明显增加;组织病理得分随细菌浓度升高而升高,随感染时间呈现先上升后下降的趋势,在感染第5天得分最高。肠道组织超微结构变化显示,攻毒组肠道微绒毛损伤脱落,形态紊乱,上皮细胞排列紊乱,线粒体水肿,出现空泡,部分细胞胞浆中细胞器溶解甚至消失,杯状细胞数目增多。各试验组炎症因子表达量的变化与细菌浓度有关,IL-15、IL-8、TNF-α和IL-1β的表达量随细菌浓度的升高而升高,且随时间呈现先上升后下降的趋势。IL-10、IL-11和TGF-β_(2)的表达量与感染浓度呈负相关,其中IL-10和IL-11的基因表达量变化显著低于对照组,TGF-β_(2)的基因表达量变化不显著。【结论】1×10^(7) CFU/mL攻毒组在整个试验过程中未出现死亡,病理学观察显示肠道有较明显的病理损伤。因此,为构建接近临床条件的细菌性肠炎模型,选择攻毒剂量为200μL 1×10^(7) CFU/mL的菌液作为肠道病理损伤模型的感染浓度。

鲮源嗜水气单胞菌的分离鉴定、生物学特性及防控药物筛选

【目的】近年来,广东省多个规模化养殖场的鲮鱼出现体表出血、腹水和肠炎等症状,明确鲮(Cirrhinus molitorella)暴发性死亡的病原菌种类及其生物学特性,筛选能有效抑制病原菌的药物或微生态制剂,为鲮鱼气单胞菌败血症的科学防治提供指导。【方法】从患病鲮鱼的肝脏和肾脏等部位分离纯化细菌,通过16S rRNA、gyrB基因测序及生理生化特征分析进行细菌鉴定,通过毒力基因PCR检测和人工感染试验分析分离菌株的致病性,利用纸片扩散法评估分离菌株的耐药性,通过拮抗抑菌试验分析3株经实验室筛选、验证并保藏的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillu velezensis)对分离菌株的抑菌效果,采用微量二倍稀释法评估12种中草药对分离菌株的抑菌和杀菌效果。【结果】根据分离菌株的形态特征、生物学特性,结合16S rRNA、gyrB基因序列分析结果,确定分离菌株为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。毒力基因PCR检测结果显示,分离菌株均携带act、aer、alt、ahyB、eprCAI、fl a、gcaT、ast、lip和exu毒力基因,属于广泛流行的毒力基因Ⅰ型菌株。回归感染试验结果表明分离菌株均具有较强致病力。药物敏感性试验结果显示,分离菌株对氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类和氯霉素类等抗生素敏感,对中草药单体姜黄素敏感度较高。贝莱斯芽孢杆菌WLYS23、CYS06和LF01菌株对分离菌株均具有较强的抑菌活性。【结论】引起鲮鱼死亡的病原菌为嗜水气单胞菌,含有10种毒力基因,具有高致病性,推荐选用多西环素、恩诺沙星或氟苯尼考进行科学防治。此外,3株贝莱斯芽孢杆菌对分离菌株具有较好的抑菌效果,可作为鲮鱼气单胞菌败血症潜在的生防益生菌,具有广泛的应用前景;中草药单体姜黄素对分离菌株的抑菌效果较好,推荐作为防控嗜水气单胞菌的绿色候选药物。

O-抗原糖基转移酶对嗜水气单胞菌环境适应性及致病性的影响

[目的]本文旨在探究4种O-抗原糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)对嗜水气单胞菌NJ-35环境适应性和毒力的影响。[方法]采用同源重组技术构建GT基因缺失株ΔGT-1、ΔGT-2、ΔGT-3和ΔGT-4,比较缺失株与野生株在体外生长、抗应激、抗吞噬、细胞黏附能力、对斑马鱼毒力以及脂多糖(LPS)表达量等方面的差异。[结果]在含有20 g·L^(-1)NaCl的高渗LB(Luria-Bertani)培养基中,相比野生(WT)菌株,4个缺失株生长均未发生明显变化;在2 mmol·L^(-1)H _(2)O_(2)的强氧化应激条件下,4个缺失株抗氧化能力显著降低,特别是缺失株ΔGT-3存活率下降90%,ΔGT-4存活率下降86.5%,另外2株缺失株存活率下降近40%;在LB培养基(pH5.0)中作用30 min,4个缺失株存活率相比野生株均明显降低,其中ΔGT-3存活率下降近30%;4个缺失株对上皮细胞的黏附能力均显著降低,抗吞噬能力均显著增强;相比野生株,ΔGT-4对斑马鱼半数致死量(LD 50)上升近20倍,其他缺失株的毒力无明显变化;4个缺失株的LPS表达量均降低,且ΔGT-1和ΔGT-4的LPS最高分子质量条带出现缺失。[结论]O-抗原糖基转移酶有助于嗜水气单胞菌抵抗酸应激和氧化应激环境,并在该菌的黏附和毒力上发挥重要作用。

嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB的原核表达及生物信息学分析

为筛选TolB作为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)渔用疫苗候选抗原,从嗜水气单胞菌中克隆了外膜蛋白tolB基因并异源表达,采用生物信息学方法预测TolB的理化性质和结构特征。结果显示,tolB基因片段(去除信号肽)全长1 263 bp,编码1条含有420个氨基酸残基的多肽,分子质量45.78 ku。成功在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中异源表达TolB蛋白,其为稳定的亲水性外膜蛋白。TolB蛋白家族在不同菌株间具有同源性,尤其在气单胞菌间亲缘关系更近。TolB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,具有潜在的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和辅助T细胞(Th)抗原表位;相互作用网络主要为TolPal系统蛋白。综上,TolB具有成为嗜水气单胞菌亚单位疫苗有效候选抗原的特性。

鳜鱼源嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

为了确定某养鱼场鳜鱼病死原因和制定治疗方案,将采集的病死鳜鱼鳃和肝脏涂布于LB培养基分离纯化细菌、革兰氏染色和涂布鉴别培养基,并通过聚合酶链式反应方法确定病原体。通过动物回归实验评价菌株致病性;最后通过药敏试验筛选敏感药物。结果显示,病原菌经革兰氏染色后呈红色短杆状;在麦康凯培养基上呈白色菌落,RS培养基上呈黄色菌落;聚合酶链式反应鉴定该菌为嗜水气单胞菌。药敏试验表明该菌株对头孢曲松、头孢哌酮等药物敏感。本研究结果可为嗜水气单胞菌的防控及制定其引起的鱼类病症治疗方案提供参考。

中草药防治嗜水气单胞菌相关疾病研究进展

嗜水气单胞菌作为水产养殖业中危害最大的、最常见的条件致病菌,严重威胁着水产养殖业的经济发展。当前防治嗜水气单胞菌的主要手段依然是抗生素,但大量抗生素的滥用导致水产养殖业中常见病原菌的耐药日趋严重。因此迫切需要绿色、安全的抗生素替代物防治嗜水气单胞菌的同时缓解耐药。中草药富含丰富的活性物质,具有良好的抗菌性和无抗药性,一直是抗生素替代物的热门选择,在防治嗜水气单胞菌相关疾病中拥有良好的应用前景。笔者综述了中草药防治嗜水气单胞菌相关疾病的抑菌机制、对细菌结构和耐药性的影响以及提高机体免疫力的作用机理,同时总结了大黄、芦荟、黄岑、厚朴、姜黄等常见单味药和复方制剂以及中西结合治疗在防治嗜水气单胞菌相关疾病中的应用情况,为中草药防治嗜水气单胞菌相关疾病的应用发展提供一定的参考。

鳗鲡嗜水气单胞菌分离及其感染防治

从发病的养殖水样及鳗鲡体表溃烂处组织分离出一株M-1菌株,经16S r RNA测序鉴定为嗜水气单胞菌。对该菌进行溶血性、药物敏感性试验,结果表明:该菌株具有溶血性,并对链霉素、庆大霉素表现敏感,而对四环素、青霉素G、左氟沙星、诺氟沙星等6种抗生素表现出耐药性。在鳗鲡感染试验中,表现出具有较强的致病性,注射约107CFU/mL病原菌液0.5 mL,72 h内致死率达100%。在养殖防治模拟试验中,20%戊二醛溶液和10%聚维酮碘溶液的防治效果与庆大霉素接近,可大幅度杀灭水体中的嗜水气单胞菌,从而降低鳗鲡死亡率。从健康、绿色养殖长远角度来看,建议采用20%戊二醛溶液、10%聚维酮碘溶液不易导致增强耐药性的杀菌药物。

嗜水气单胞菌RND外排泵中药抑制剂的筛选

随着抗生素的滥用,抗菌药物耐药性(Antimicrobial resistance,AMR)已经成为重大公共卫生问题。研究表明革兰氏阴性菌中普遍存在的RND (Resistance Nodulation Division)外排泵在细菌多重耐药机制中扮演了关键角色。RND外排泵抑制剂(efflux pump inhibitors, EPIs)可以将大大降低细菌的耐药性。化学药物类抑制剂虽然抑制效果好,但副作用大,限制了其在临床和水产养殖业上的应用。已证实多种植物及其成分有抑制细菌产生耐药性和消除耐药性等作用,因此中草药成为筛选外排泵抑制剂的巨大宝库。本研究选用了利血平、N-甲基吡咯烷酮、板蓝根、黄芪、连翘、黄连等中药作为抑制嗜水气单胞菌耐药性的候选药物,结果表明利血平的抑菌效果和抑制耐药性的效果最显著,黄连次之。联合药物作用实验结果显示,利血平和OXY在2.5 μg/mL和10 μg/mL的作用下抑菌效果显著。Western blotting结果显示,RND外排泵中的AcrA蛋白的表达量随着利血平浓度的上升而下降,推测说明利血平可能是通过抑制AcrA蛋白的表达来抑制外排泵的外排效率,从而降低嗜水气单胞菌的耐药性。本研究为中药抗生素联合制剂在临床和水产养殖上的应用提供分子基础,为解决细菌耐药性提供理论依据和参考。

三角帆蚌CypA基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染后的表达分析

为研究亲环蛋白A(Cyclophilin A,CypA)在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)免疫系统中的作用,研究利用PCR与RACE技术克隆获得三角帆蚌CypA基因全长cDNA序列(基因序列登录号:MN121742)。三角帆蚌CypA基因cDNA序列全长1237 bp,其5′非编码区(UTR)长度为57 bp,3′非编码区长度为688 bp,三角帆蚌CypA基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长度为492 bp,编码164个氨基酸,CypA蛋白质理论等电点为8.9,相对分子量为17.29 kD。在GenBank中进行同源序列检索,三角帆蚌CypA氨基酸序列与其他贝类CypA的相似性依次为池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)(99.39%)、青蛤(Cyclina sinensis)(77.44%)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)(78.05%)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)(78.66%)和大竹蛏(Solen grandis)(75.05%)。通过SWISS-MODEL预测三角帆蚌CypA含有8个β折叠和2个α螺旋,可能形成CypA的活性中心区域。利用MEGA 5.1软件将三角帆蚌CypA与其他物种CypA基因进行序列比对并构建系统进化树,分析发现三角帆蚌CypA与池蝶蚌的CypA聚为一支,其与池蝶蚌CypA具有最近的亲源关系。通过qRT-PCR检测CypA基因在三角帆蚌不同组织中表达,发现三角帆蚌性腺中CypA基因的表达量最高,肝脏、肾和鳃中的表达量次之。对三角帆蚌浸泡感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),CypA基因在肝脏、性腺、肠和鳃中的表达水平在感染72h先升高后降低,其表达量在性腺和鳃中6h最高,肝脏中12h达到峰值,肠中24h达到最高值,表明三角帆蚌感染嗜水气单胞菌后,可显著诱导CypA基因的表达。CypA基因在性腺中的表达量到达峰值的时间要早于肠与肝脏,且到达峰值时的相对表达量(14.91)也显著高于肝脏(9.89)、肠(9.78)和鳃(7.53),推测CypA在三角帆蚌性腺中具有防御细菌感染的重要作用,三角帆蚌性腺可能不仅具有生殖的功能,同时在免疫防御系统中也发挥着重要的作用。

嗜水气单胞菌Hcp蛋白的原核表达·多克隆抗体制备及生物信息学分析

[目的]获得嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)Hcp蛋白的多克隆抗体(Polyclonal Antibody)及基本生物学特性。[方法]利用RT-PCR方法扩增Hcp基因,构建重组表达质粒后转化BL21感受态细胞,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thiogalactoside)诱导表达获得Hcp重组蛋白,纯化后免疫家兔,制备针对该蛋白的多克隆抗体,进行抗体的效价测定、Western blotting鉴定,利用生物信息学在线工具对其基本理化性质、保守结构域、磷酸化位点、二级与三级结构进行预测。[结果]该蛋白在IPTG终浓度为0.6 mmol/L、37℃下诱导表达6 h可获得最高表达量,蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在;Western blotting结果显示,AH的培养物上清与沉淀均能够与制备的兔抗发生特异性结合,具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1.024×10^(6)。生物信息学分析表明,嗜水气单胞菌Hcp蛋白的分子式为C_(846)H_(1304)N_(224)O_(259)S_(8),共编码172个氨基酸,相对分子质量为19013.49 u,等电点(PL)为5.24,属于稳定蛋白;二级结构中无规则卷曲占比为51.74%,延伸链占比为25.00%,α-螺旋占比为19.19%,β-转角占比为4.07%。[结论]成功制备了Hcp蛋白的多克隆抗体,为进一步研究AH的VI型分泌系统(Type VI secretion system,T6SS)提供技术支持。

丁香多糖的提取及其对嗜水气单胞菌抑制活性研究

本文通过单因素实验,考察了提取温度、提取时间、料液比和醇沉体积分数对丁香多糖提取率的影响,并通过正交试验,以多糖提取率作为评价指标,进一步优化丁香多糖提取工艺。采用滤纸片扩散法考察了丁香多糖对嗜水气单胞菌抑制活性。研究发现,该方法在实验时间内稳定,精密度、重复性、稳定性良好。加样回收试验表明,该方法平均回收率为99.82%,RSD为1.23%。深入研究发现,将提取温度设定为90℃,提取时间设定为120 min,料液比设定为1∶60,醇沉体积分数设定为80%,丁香多糖提取工艺最佳。进一步研究发现,丁香多糖对嗜水气单胞菌表现出较好的抑制效果,MIC为12.5 mg/mL。该工艺简单稳定,丁香多糖抑制嗜水气单胞菌明显,为该资源的进一步开发提供了研究基础。

鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

致病性嗜水气单胞菌耐受性及其相关蛋白HSP60的分离与鉴定

[目的]为了了解致病性嗜水气单胞菌的耐受性调控机制。[方法]根据GBT18652—2002《致病性嗜水气单胞菌检验方法》从病鱼病灶上分离获得致病性嗜水气单胞菌,进行耐盐、耐酸碱、耐药性试验及不同环境影响下该菌的菌体蛋白提取,并对差异蛋白进行质谱鉴定。[结果]该致病性嗜水气单胞菌在35‰盐度和pH=6的环境下增长快;对喹诺酮类药物最为敏感,对磺胺类和氯霉素类抗生素具有耐药性;对35~73ku处有明显变化的条带进行蛋白分离,质谱鉴定为HSP60。[结论]该菌的HSP60蛋白受盐度和酸碱度影响,参与耐受性调控。