嗜水气单胞菌J-1株粘附素及其受体分析

以EPC细胞和HEp 2细胞为细胞模型 ,用嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila ,Ah)J 1株进行粘附试验 ,同时以Ah4型菌毛的抗血清作粘附抑制试验 ,用以分析AhJ 1株的粘附素及其受体。EPC细胞粘附和粘附抑制试验证实 ,AhJ 1株粘附素受体具有甘露糖、胆固醇成分 ,有少量半乳糖成分 ,无葡萄糖成分。HEp 2细胞粘附和粘附抑制试验证实 ,与其它非菌毛粘附素如S层及外膜蛋白相比 ,Ah 4型菌毛的粘附作用较为显著。抗 4型菌毛抗体抑制细菌的粘附力达 80 %以上。抗S层、外膜蛋白抗体也能使细菌的粘附力下降 ,表明Ah的粘附作用由菌毛粘附素与非菌毛粘附素共同参与。

嗜水气单胞菌J-1株丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列,设计和合成了一对引物,以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段,并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析,结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％,扩增片段编码343个氮基酸,推测的分子量为35700,计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性,可作为核酸疫苗的侯选基因片段。

嗜水气单胞菌J-1株弹性蛋白酶的表达、纯化及特性分析(英文)

【目的】表达、纯化嗜水气单胞菌J-1株弹性蛋白酶,并对弹性蛋白酶的性质进行分析。【方法】以pET-32a为表达载体将弹性蛋白酶基因ahyB转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,表达重组酶用HisTaqNi2+亲和层析柱纯化并用6mol/L盐酸胍进行复性;利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析对嗜水气单胞菌培养上清液中的弹性蛋白酶进行纯化。【结果】从嗜水气单胞菌培养上清液中获得的弹性蛋白酶原酶的最适pH为8.5,而表达重组酶为10.0;对热的稳定性,原酶高于表达酶。两种形式酶的性质有一些相似性,其酶活性都能被EDTA、OPA金属蛋白酶抑制剂抑制,而表达酶对抑制剂的耐受性要高于原酶。金属离子Zn2+、Fe2+能抑制酶的活性。【结论】两种形式的弹性蛋白酶均属于Zn2+/Fe2+型金属蛋白酶,且具有相似的酶学性质。本研究为弹性蛋白酶酶学反应机制的深入研究及其应用奠定了基础。

嗜水气单胞菌J-1株外膜蛋白Omp38的抗原性分析

根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白Omp38的基因序列设计引物,以Ah J-1株基因组为模板,扩增omp38基因片段,定向克隆至表达质粒pET32 a中,将重组原核表达质粒pET32 a-omp38转化至大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量约35 ku的重组蛋白。用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA检测抗体效价为1∶25 600,表明该蛋白有良好的免疫原性。PCR检测表明,omp38基因可在73%(22/30)的嗜水气单胞菌中发现。重组蛋白抗血清与30株嗜水气单胞菌分离株进行凝集试验,所有分离株均可在不同程度上发生反应,表明该重组蛋白是一种潜在的共同保护性抗原,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。

嗜水气单胞菌BSK-10株的优化培养条件研究

用正交试验研究了嗜水气单胞菌BSK - 10株的优化培养条件。结果表明 :葡萄糖、甘油对BSK - 10株有显著的促生长作用 ;各种无机离子中 ,HPO4 2 - 、Fe2 + 、Ca2 + 、(NH4 ) 2 SO4 、Mg2 + 、Zn2 + 、Mn2 + 对BSK - 10生长有显著促进作用 ,而Cu2 + 、Co2 + 则表现为抑制作用 ;Na2 HPO4 与各种离子间存在交互作用 ,Fe2 + 、Mg2 + 、Zn2 + 、Mn2 + 的促生长作用在Na2 HPO4 的存在时表现得极为明显 ,而 (NH4 ) 2 SO4 、Mn2 + 在Na2 HPO4存在时有轻微抑制作用 ;葡萄糖对不同来源的鱼类嗜水气单胞菌致病株有不同的效应。BSK - 10的生长动态研究表明 ,不同温度下BSK - 10株达到对数生长及最大菌量的时间不同 ,以 30℃为最佳。

筛选用转座子Tn916诱变的具有免疫原性的嗜水气单胞菌蛋白酶缺失株

以携带质粒pAM120(Ap^t、Tc^t／Tn916)的大肠杆菌(Ecoli)CG120株为供体菌，与受体菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)J-1株，采用滤膜接合法进行接合转移，在选择平板(含Tc、cfz和脱脂奶)上进行筛选，筛选出6株蛋白酶缺失株(ECPase)，ECPase菌株其生长速度，对正常鲫鱼血清的抗性降低，用脱脂奶平板法及底物法检测，蛋白酶产量明显降低。与亲本J-1株相比，突变株致病力降低．对鲫鱼的半数致死量大于10^8(J-1株对鲫鱼的半数致死量为5×10^3)。用ECPase突变株MJ-1株的18h培养物(5×10^6CFU)接种健康鲫鱼，不产生亲本J-1株引起的病变及死亡。用MJ-1活菌免疫鲫鱼，在第5周产生较高的凝集抗体，且对强毒株J-1的攻击有保护作用。表明蛋白酶是嗜水气单胞菌的一个重要的毒力因子。ECPase突变株仍具有免疫原性。

江西地区嗜水气单胞菌流行株的生物学特性

从江西不同地区分离到多株嗜水气单胞菌 (Ah) ,选取有代表性的 1 4株菌做生物学特性鉴定。发现这1 4株Ah培养特性一致 ,生化特性除糖类发酵存在差异外 ,其它均一致。均可产生强的毒素 ,对动物的致病性均很强。1 4株Ah菌对环丙沙星、痢特灵、阿米卡星、卡那霉素均高敏。

注射鳖源致病性嗜水气单胞菌ZHYYZ-1引发中华鳖(Trionyx sinensis)稚鳖感染和致死的定量研究

以20日龄中华鳖稚鳖为实验动物,采用静水停食实验法,在水温(27.4±1.3)℃、pH7.1条件下,进行了注射鳖源嗜水气单胞菌ZHYYZ-1引发中华鳖稚鳖感染和致死的定量实验研究。结果表明:(1)该菌为高致病性菌株,异常排泄是该菌致稚鳖表露临床感染症状的重要标志;(2)注射该菌引起稚鳖感染与致死具明显的剂量—时间效应,随注射菌量递增依次出现不表露临床感染症状、表露临床感染症状而不出现死亡和大量死亡三种情形,稚鳖表露临床感染和出现死亡的时间均随注射菌量增大而明显缩短,绝大多数稚鳖表露临床感染和出现死亡的时限分别为2h和48h;(3)濒死稚鳖体内该菌的底限含量为3.3×106CFU/g,稚鳖体内菌注射含量可控安全范围为(1.2—8.8)×103CFU/g。

致病性嗜水气单胞菌耐喹诺酮类药物菌株的分离鉴定

对吉林省内 12个水域采集和送检的 6 6尾病鱼进行了细菌分离鉴定 ,共检出 4 6株嗜水气单胞菌疑似菌 ,通过生化试验结合 PCR扩增气溶素基因 Aer,确定其中 2 2株为致病性嗜水气单胞菌。进一步采用纸片扩散法和双倍稀释法测定嗜水气单胞菌分离株对多种抗生素的耐药性 ,其中有 4株对喹诺酮类药物耐药 ,并且为交叉耐药 ,耐药菌检出率为 18.2 % ,纸片扩散法检测其对喹诺酮类药物的抑菌圈均小于 19mm。将病料中分离的 8株嗜水气单胞菌负染后电镜观察 ,耐药菌表面有许多大小不同的球形结构 。

鲤鱼细菌性败血症及穿孔病病原菌与嗜水气单胞菌标准株特性的比较研究

从发病渔场分离的鲤鱼细菌性败血病S - 1、S - 2致病菌株 ,鲤鱼穿孔病S - 3、S - 4致病菌株 ,与嗜水气单胞菌标准株作为对照 ,进行人工感染试验对健康鲤鱼具有很强的致病力 ,出现与自然病鲤相似的症状 ,并从人工感染发病鱼体内分离出同样特性的菌株 ,通过菌体形态 ,培养特性和生化反应等测定 ,符合嗜水气单胞菌的特性 ,并与嗜水气单胞菌标准株作平行试验 ,结果一致 ,确定鲤鱼细菌性败血症和穿孔病均是同一病原 。

鳖嗜水气单胞菌甘肃株和上海株的生物学特性比较

通过对甘肃灵台县和上海市奉贤县水产养殖场患病鳖病原菌的分离、培养、鉴定，两地菌株均为嗜水气单胞菌。经过对该菌形态学、革兰氏染色、21项生理生化特性比较，以及两菌株毒力比较和动物感染试验，表明甘肃菌株（G－97－7）和上海菌株（S－96－10）是引起鳖白点病（疖疮）、穿孔病（鳖甲溃烂）和出血等细菌性疾病的原发性致病菌。该病菌广泛地存在于自然界水体中。

一株鲢鱼肠道中嗜水气单胞菌拮抗菌株的筛选、鉴定及特性

从鲢鱼肠道中筛选嗜水气单胞菌的拮抗菌株,并对生长培养条件进行研究,以期为鲢鱼养殖过程中嗜水气单胞菌病的生物防治提供理论依据。通过对鲢鱼肠道中嗜水气单胞菌拮抗菌株的分离、筛选,并对其中拮抗作用较稳定的菌株进行生理生化、分子鉴定以及生长培养特性优化。经过多次筛选得到了15株拮抗效果较好的目标菌株,其中拮抗作用较稳定的S4为气单胞菌属,是偏碱性革兰氏阴性短杆菌;通过单因素和正交实验表明,S4最佳生长培养条件为1.5 g/d L淀粉,1.5 g/d L牛肉膏,1 g/d L氯化钙,32℃,pH 8.5,接种体积分数3%。研究结果为嗜水气单胞菌的防治及拮抗菌S4的应用提供理论依据。

齐口裂腹鱼HMGB1基因克隆及其对嗜水气单胞菌胁迫的响应

为了解齐口裂腹鱼高迁移率蛋白B1 (Schizothorax prenanti high mobility group box1,SpHMGB1)的序列特征及其与嗜水气单胞菌胁迫的相关性,实验根据齐口裂腹鱼脾脏TSA库中获得的序列设计引物,采用克隆技术克隆SpHMGB1的核心序列并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR (qPCR)技术检测嗜水气单胞菌在体和离体胁迫后组织和巨噬细胞中Sp HMGB1的响应情况。序列分析结果显示,Sp HMGB1开放阅读框长为615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量为23.5 ku,等电点为6.79,包含2个基本的HMG盒:A盒和B盒,以及一个酸性尾巴。SpHMGB1二级结构主要由47.06%的α-螺旋和50%的无规则卷曲构成。系统进化树分析显示,SpHMGB1与鱼类HMGB1聚为一支,与斑马鱼和鲫的亲缘关系最近,氨基酸一致性分别为90.7%和90.4%。qPCR检测结果显示,嗜水气单胞菌感染后SpHMGB1具有不同的时空表达趋势,其中血液在72 h表达量最高,肾脏在6 h表达量最高,脾脏在120 h表达量最高;热灭活嗜水气单胞菌刺激巨噬细胞后,SpHMGB1的表达量在0.5～24 h下调,24 h表达量最低,细胞因子IL-1β和TNF-α表达量均有上调趋势。qPCR检测结果提示,SpHMGB1可能参与齐口裂腹鱼细菌感染后的免疫响应。本实验可为进一步研究SpHMGB1在齐口裂腹鱼细菌性疾病中的免疫调节机制提供参考。

鳖致病性嗜水气单胞菌甘肃株和上海株对抗菌药物的敏感性比较

要通过痢特灵等１８种药物纸片对嗜水气单胞菌甘肃株和上海株的测试，以及两菌株对氧哌嗪青霉素、新霉素等７种药物敏感性和两菌株间差异显著性测定，得出１８种抗菌药物对两菌株敏感性的不同反应，对甘肃和上海菌株均呈高度敏感（＋＋＋）的药物有氧哌嗪青霉素、新霉素、庆大霉素（此３种为首选抑菌药物）、妥布霉素、卡那霉素和链霉素等６种；均不敏感（－）的有氨苄青霉素、磺胺和青霉素３种；对两菌株表现不同敏感性的有痢特灵、丁胺卡那等９种。

巨蜥源嗜水气单胞菌分离株的病原特性分析

从 3批均以呼吸道症状和出血性胃肠炎为主要特征的死亡巨蜥中获得 3株嗜水气单胞菌。其培养性状及生化特性基本一致 ,均可产生β-溶血环。分离株对小鼠有较强的致病性 ,对PG、COS、VAN、CIP、NOR、CAR耐药。 3个菌株具有相同的菌体 (O)抗原血清型 ,该血清型与嗜水气单胞菌参考菌株 J1不同。

嗜水气单胞菌生物被膜形成突变株的筛选及其特性

为研究调控基因对嗜水气单胞菌生物被膜的形成机制,本研究利用二亲本结合转座的方法,将携带mTn5gusA-pgfp21的载体pFAJ1819导入嗜水气单胞菌野生株AH7中进行转座突变。通过对153株突变株的生物被膜测定,筛选出形成被膜能力较高的AHΔ82和形成被膜能力较低的AHΔ148。扫描电镜观察显示AHΔ82生物被膜最致密,其次是AH7,AHΔ148较疏松。SDS-PAGE电泳表明,与AH7相比,两个突变株在25 ku和35 ku之间缺少一条带,AHΔ82比野生株多3条蛋白条带。毒力测定表明3株细菌的毒力强度为:AH7>AHΔ148>AHΔ82,突变株毒力降低。实验结果提示Tn5转座子的插入突变影响细菌生物被膜的形成和毒力。

抗嗜水气单胞菌AH1血清交叉免疫反应的评价

本研究利用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)AH1腹腔注射小白鼠,测定半数致死量LD50为1.35×107.在此基础上制备抗嗜水气单胞菌AH1血清(抗AH1血清),采用凝集反应测出抗AH1血清的效价为25,600.进一步分析抗AH1血清对温和气单胞菌(Aeromonas sobria)等13种致病菌的交叉免疫反应,结果表明,抗AH1血清与气单胞菌属细菌、弧菌属细菌和假单胞属细菌之间的交叉反应程度比较大,而与其它属细菌之间存在的交叉反应程度小,或不存在交叉反应.