一株嗜热子囊菌产生的碱性耐热过氧化氢酶及其应用潜力

研究了一株嗜热子囊菌产过氧化氢酶的摇瓶发酵条件 ,并对其在纺织工业中的应用潜力进行了评价。以2 0g L糊精和 1% (V V)乙醇为混合碳源时 ,过氧化氢酶酶活达到 15 94u mL ,比以糊精和乙醇单独为碳源时过氧化氢酶的活力之和还高 2 3%。改变培养基的初始pH、提高发酵液中的溶氧水平及添加外源过氧化氢 ,过氧化氢酶的产量进一步提高到 2 76 2u mL ,比优化前提高了 5 8倍。将嗜热子囊菌的过氧化氢酶同来源于牛肝、黑曲霉的过氧化氢酶进行了热 (70℃ ,80℃ ,90℃ )、碱 (pH 9 0 ,pH 10 0 ,pH 11 0 )稳定性的比较。结果显示 ,产自嗜热子囊菌的过氧化氢酶对高温和强碱性的耐受性能明显优于其它来源的酶 ,在纺织染整工艺中具有良好的应用潜力。

添加甲萘醌促进嗜热子囊菌合成过氧化氢酶

研究了添加甲萘醌对嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)IFO9862合成过氧化氢酶(CAT)的影响.结果表明,添加甲萘醌有助于促进CAT的合成.在发酵的24或48h分别添加1μmol/L的甲萘醌,发酵终了CAT酶活比对照分别提高了11.0%和23.1%;而在发酵的36和48h各添加1μmol/L的甲萘醌,CAT酶活可提高32.5%.在发酵0h添加88mmol/L的H2O2,同时在48h添加1μmol/L的甲萘醌,CAT酶活达到1725U/mL,比对照(1074U/mL)提高了60.6%.

高产木聚糖酶嗜热子囊菌固体发酵条件与酶学性质

以本实验室从土壤中分离筛选到的一株高产木聚糖酶的嗜热子囊菌QS7-2-4为生产菌种,进行固体发酵产木聚糖酶的发酵条件研究,结果表明最佳产酶条件为:玉米芯:麸皮为7:3(w/w);最佳氮源为酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源,添加量为1.5%;吐温-80添加量为0.5%,初始pH为7.2,培养基含水量为80%,250mL三角瓶装料量为8g,发酵温度50℃,发酵时间72h,该条件下木聚糖酶产量达27952U/g干基。该酶最适反应温度为75℃,最适反应pH为4.5,在70℃以下具有良好的稳定性,在室温下储藏150d仍然保留87%的活性。

嗜热子囊菌利用短链有机酸生产角质酶

以嗜热子囊菌(Thermobifida fusca WSH03-11)发酵生产角质酶为模型,研究微生物利用市政污泥厌氧酸化所产短链有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可能。发现:(1)以丁酸、丙酸和乙酸为碳源时,有机酸和氮元素浓度分别为8.0g/L和1.5g/L有利于角质酶的生产;而以乳酸为碳源时,最适有机酸和氮源浓度分别为3.0g/L和1.0g/L;(2)改变诱导物角质的浓度,以丁酸、丙酸、乙酸和乳酸为碳源,分别比优化前提高了31.0%、13.3%、43.8%和73.2%;(3)在四种有机酸中,T.fuscaWSH03-11利用乙酸的速率最快,平均比消耗速率是丙酸的1.3倍,丁酸的2.0倍及乳酸的2.2倍;以丁酸为碳源时的酶活(52.4U/mL)是乳酸的1.7倍、乙酸的2.5倍和丙酸的3.2倍;角质酶对乳酸的得率(12.70u/mg)分别是丁酸的1.4倍、丙酸的3.0倍和乙酸的3.8倍;(4)以混合酸为碳源生产角质酶,T.fusca WSH03-11优先利用乙酸,而对丁酸的利用受到抑制。进一步研究发现,混合酸中0.5g/L的乙酸将导致丁酸的消耗量降低66.7%。这是首次利用混合酸作碳源发酵生产角质酶的研究报道。这一研究结果进一步确证了利用市政污泥厌氧酸化所产有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可行性,为以廉价碳源生产角质酶奠定了良好的基础。

嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bglⅠ的全长序列,cDNA序列为2672bp,Genbank登录号为EU269025,将该片段插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K/bgl,经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,在醇氧化酶AOX1基因启动子作用下,获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株.经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组表达蛋白.SDS-PAGE测得该重组蛋白相对分子质量(Mr)约为120×103.经甲醇诱导,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达1.2U/mg,小规模发酵量达0.45mg/mL.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0.于70℃保温30min仍保持80%的酶活力,具有较高的热稳定性,在pH3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强.

嗜热子囊菌两个中国新记录种

对采自云南的标本进行研究,描述了两种嗜热子囊菌中国新记录种,分别是太瑞斯梭孢壳霉[Thielavia terrestris (Apinis) Malloch & Cain]和丝衣霉状篮状菌[Talaromyces byssochlamydioides Stolk & Samson],附插图。研究标本保存在山东农业大学植物病理学标本室(HSAUP)。

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporusβ-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性研究

采用室内培养、测定方法,对嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus产生的β-葡萄糖苷酶进行了分离纯化及特性研究。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。结果表明,经12%SDS-PAGE测得酶的单亚基分子量约为118kDa,凝胶过滤层析测得酶的分子量约为350kDa。该酶反应的最适温度和最适pH分别为80℃和4.5￣5.0,在pH5.0条件下,该酶在70℃条件下基本稳定,80℃保温30min,剩余酶活为15%。金属离子对β-葡萄糖苷酶活性影响较大,其中Ca2+、Ba2+对酶有激活作用;Ag+、Fe3+、Cu2+对酶有显著的抑制作用。该酶对水杨苷具有很强的底物特异性。

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

采用培养分离、室内测定等方法,对嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus产生的内切β-葡聚糖酶进行了分离纯化及特性研究.粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的内切β-葡聚糖酶.结果表明,经12%SDS-PAGE测得酶的单亚基分子量约为31.5 kD,凝胶过滤层析测得酶的分子量约为34.5 kD.该酶反应的最适温度为55℃,最适pH为2.5～3.0.该酶在pH3.0条件下60℃较为稳定;80℃保温30 min有20%原酶活性.金属离子对内切β-葡聚糖酶活性影响较大,其中K+、Ca2+、Mn2+对酶有激活作用;Ag+、Cu2+、Al3+对酶有显著抑制作用.该酶对羧甲基纤维素具有很强的底物特异性.

嗜热子囊菌光孢变种内切葡聚糖酶I基因在毕赤酵母中的表达及部分酶学性质

嗜热子囊菌是一种嗜热真菌,可以产生具有很高工业价值的内切葡聚糖酶.本研究成功表达了嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Ⅰ基因,并获得热稳定的重组内切葡聚糖酶.提取嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)总RNA,通过RT-PCR方法克隆出内切-β-葡聚糖酶eg1基因的成熟肽编码序列.采用基因重组的方法构建该基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K-eg1,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,大量筛选后获得高效表达内切葡聚糖酶Ⅰ的毕赤酵母工程菌株GpN24.该菌株采用甲醇诱导120h后,内切葡聚糖酶Ⅰ的活力可达570.7U/mL,最适温度为55℃,在90℃的条件下保温30min后仍具有60%的酶活力;最适pH为5.0,在pH3.0～5.0的条件下酶活力保持稳定.

混合添加乙醇和H_2O_2对嗜热子囊菌产过氧化氢酶的影响

在以嗜热子囊菌(T.aurantiacus WSH03-01BC)生产过氧化氢酶的7L罐发酵研究中,发现混合添加适量的乙醇(75%)和H_2O_2可以促进菌体产酶。在发酵36h和48h分别添加0.8%(v/v)的乙醇时,酶活比对照提高了34.3%;当添加乙醇的总量超过2.4%时,对菌体的生长及产酶有明显的抑制作用;在发酵36～60h恒速流加1.6%的乙醇,CAT的酶活达到2519U/mL,单位细胞产酶能力提高了47.3%;在发酵36h～60h恒速流加1.6%的乙醇并在48h混合添加0.4%的H_2O_2时,CAT的酶活达到2786U/mL,比对照提高了50.1%。

嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)固态发酵姜苗产内切β-葡聚糖酶条件优化

姜苗营养丰富,但作为饲料存在粗纤维含量高而消化吸收率低的难题。内切β-葡聚糖酶主要由真菌代谢产生,可有效降解纤维素中的葡聚糖。本研究在单因子条件的基础上,探讨应用Plackett-Burman和中心组合设计等方法得到嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)固态发酵姜苗生产β-葡聚糖酶的最适发酵条件。结果表明,最佳培养基组成是姜苗70%(w/w)、豆粕30%(w/w)、初始含水量61.0%、尿素1.70%(w/w),KH2PO40.13%(w/w),Ca Cl20.1%(w/w)(固体培养基的总量)。在上述培养基中50℃培养72 h,β-葡聚糖酶活力可达682.8 U/g,与原始培养条件相比酶活提高了51.2%.

嗜热子囊菌JCM12803来源的阿魏酸酯酶FAE-2515酶学性质研究

阿魏酸酯酶广泛应用于食品、药品、饲料及造纸等行业,挖掘适用于工业化的阿魏酸酯酶至关重要。从嗜热真菌Thermoascus crustaceus JCM12803中克隆得到一个阿魏酸酯酶基因FAE-2515,经基因序列分析,FAE-2515 c DNA全长为1 581 bp,编码526个氨基酸和1个终止子,理论分子量大小为57 k Da,等电点为5.08。将FAE-2515成功地在毕赤酵母中实现高效异源表达,通过对重组蛋白进行酶活测定,比活为(53.653±3.451)U/mg,Kcat/Km值为1.423,最适pH为6.0,最适温度为55℃,60℃处理1 h之后还能保持60%的酶活,热稳定性较已报道的同类酶更为稳定。以阿魏酸甲酯为底物时酶活表现为最高,以硝基苯棕榈酸酯为底物时几乎没有酶活。金属离子K^+、Ca^(2+)、Na^+对该酶有显著的促进作用,Fe^(3+)、Zn^(2+)对该酶有轻微抑制作用,Mn^(2+)、Cu^(2+)对该酶有显著的抑制作用。综上,该酶在造纸工业和动物饲料制备工业中具有一定优势。

嗜热子囊菌JCM12803来源的双功能木聚糖/纤维素酶

纤维素和木聚糖的充分利用对于生物燃料的生产是非常重要的。文中利用PCR的方法从嗜热子囊菌Thermoascus crustaceus JCM12803中克隆到一个新颖的双功能木聚糖/纤维素酶基因Tcxyn10a,并将其在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中实现高效异源表达。经过蛋白纯化和酶学性质研究分析,TcXyn10A的最适pH值和最适温度分别为5.0和65-70℃,能够在酸性至碱性(pH 3.0-11.0)条件下和60℃下保持稳定;对榉木木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、羧甲基纤维素钠和地衣多糖均有降解活性,比活分别为(1 480±26)U/mg、(2 055±28)U/mg、(7.4±0.2)U/mg和(10.9±0.4)U/mg;同源建模结构以及分子对接试验表明,双功能酶TcXyn10A只含有单一催化结构域,且木聚糖底物与纤维素底物共用一条催化通道。文中为探索双功能酶结构与其功能的关系提供了很好的素材。

嗜热真菌热稳定性β-葡萄糖苷酶的克隆表达、纯化及酶学性质

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)中克隆出β-葡萄糖苷酶基因bglII的全长序列,GenBank注册号为EU263992。将该基因插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中以获得重组质粒,将重组质粒转导入毕赤酵母中,大量筛选后获得高效表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌株。经甲醇诱导6d,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达0.23U/mg。该酶的最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃。通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组蛋白质。SDS-PAGE测得该重组蛋白质分子量约为118kDa。

中国大陆嗜热真菌2新记录种

从采自海南的标本中分离到2个中国大陆新记录种——嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)和黄褐毁丝霉(Myceliophthora hinnulea),并进行了形态学描述。研究标本保存于山东农业大学植物病理学标本室(HSAUP)。

一种嗜热嗜碱过氧化氢酶的分离纯化和固定化

引言过氧化氢酶（catalase，简称CAT，EC1．11．1．6）是一种高效催化分解过氧化氢的酶，广泛存在于好氧微生物和动植物体内。在纺织印染工业、造纸工业、废水处理、纸浆、牛奶保鲜以及临床分析等方面有着广泛的应用¨…。其中嗜热嗜碱过氧化氢酶由于其独特的耐热耐碱性质，已有多篇文献报道该酶在处理纺织业漂白废水中残留Hz2oz2的应用研究 ^[4-8]。

一株产木聚糖酶菌株的鉴定及产酶条件研究

【目的】对一株从木薯渣堆中分离得到的产木聚糖酶嗜热真菌JG-50菌株进行分类鉴定,并研究其利用木薯渣固态发酵产酶的最佳条件,为该菌株在农业有机废弃物发酵利用中的应用提供理论依据。【方法】采用真菌形态学观察和26S rDNA基因D1/D2区序列同源性分析方法对JG-50菌株进行分类鉴定,并以单因素试验方法对JG-50菌株产木聚糖酶的最佳碳源、氮源、培养时间、培养温度和培养基初始pH等发酵条件进行优化。【结果】菌株JG-50与嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus isolate MTCC 4890)的26S rDNA序列相似性为99%,结合形态学特征初步鉴定为嗜热子囊菌属的一种。该菌株能以木薯渣为碳源固态发酵产木聚糖酶,其产酶的最佳条件为:以木薯渣为碳源,添加60%麦麸,0.3%蛋白胨和0.2%酵母粉,pH6.0,以此培养基50℃培养8 d,木聚糖酶活可达4625.4U/g(干培养基)。【结论】嗜热真菌JG-50具有较强的产木聚糖酶能力,在农业有机废弃物发酵利用领域具有良好的应用前景。

Thermoascus aurantiacus产耐热木聚糖酶水解活性的培养条件优化

在前期研究的基础上,利用SPSS进行主成分分析,构建了催化水解玉米芯的综合水解能力指数(XCHI);然后以XCHI为自变量,水解玉米芯的还原糖得率为因变量进行回归分析,回归分析模型证明了综合水解能力XCHI与糖得率之间存在相关关系,以XCHI为响应值,正交实验优化得到T.aurantiacus CGMCC11334产Xyn水解玉米芯能力的最适培养基组成为:麸皮16 g/l、微晶纤维素7 g/l、牛肉浸膏4 g/l、玉米浆3 g/l、小麦蛋白胨4 g/l、KH_2PO_4 1.0 g/l、MgSO_4 2.0 g/l、CuSO_4 0.00 g/l、Fe-SO_4 0.05 g/l、VB1 0.15 g/l;在此条件下,Xyn、CMC和FPA的活性分别为135.12、1.95 U/ml和1.68 U/ml,XCHI为1 649.44。

红心曲来源Thermoascus aurantiacus QH-1的生长代谢特征

为探究黄嗜热子囊菌的生长代谢特征,对红心曲来源的黄嗜热子囊菌QH-1的最适生长条件、乙醇耐受性、生长曲线及糖化酶液化酶等进行了分析。结果显示,黄嗜热子囊菌QH-1在PDA,MEA和SDA丰富培养基中生长迅速且有色素,在合成培养基察氏及G25N培养基上生长的菌落生长较慢几乎没有色素;黄嗜热子囊菌QH-1的最适生长条件为:温度45℃,pH4.0,接种量3%,装液量160 mL;该菌株最低和最高生长温度分别为26和60℃;制曲酿酒原料中,高粱米为其生长最佳原料,6%的乙醇不会影响其生长;在大麦豌豆固态培养基中前期生长缓慢,糖化酶活性较低,6~8 d生长速度加快,糖化酶活性增加,生长曲线与糖化酶曲线较为相似,第10 d检出液化酶。研究结果为该菌株进一步开发利用提供必要信息。

过氧化氢酶发酵生产条件优化及在染整清洁生产中的应用研究

在以嗜热子囊菌生产过氧化氢酶的摇瓶发酵研究中,获得了适合工业化生产的碳源,即以26g/L的糊化玉米淀粉和1%(v/v)乙醇为混合碳源,过氧化氢酶的酶活达到了1996 u/mL,比优化前提高了25%。在此基础上,重点研究了发酵罐上的主要影响因素溶解氧对发酵的影响,通过分段控制搅拌转速,在52h将搅拌转速从200r/min提高到350r/min,过氧化氢酶最高酶活达到4505 u/mL,与不使用控制溶氧水平策略相比,酶活力提高了2.4倍。此外,还考察了该酶去除过氧化氢的效率,并在实际纺织生产中进行了应用实验,取得了良好的效果。