嗜热毛壳菌纤维素酶(CBHⅡ)cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilumCT2是一种土壤腐生菌,可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RACEPCR获得嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHⅡ)的编码基因(cbh2)。DNA序列分析表明cbh2的开放阅读框由1428个碱基组成,编码476个氨基酸。推断的氨基酸序列包含一个典型真菌纤维素酶的糖结合域(CBD)、催化域(CD)以及二者之间富含脯氨酸和羟基氨基酸的连接桥。根据氨基酸序列推算该酶分子量为53kD,属于糖苷水解酶第六家族,具有该家族催化保守区的典型特征。PCR扩增cbh2的成熟蛋白编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶蛋白的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.2mgmL。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fastflow阴离子层析等步骤纯化了该重组表达蛋白。SDSPAGE得到重组蛋白分子量为67kD,与从嗜热毛壳菌中纯化的该酶分子量一致。该重组纤维二糖水解酶作用的最适合温度50℃,最适pH4.0,在70℃的半衰期为30min,具有较好的热稳定性。

嗜热毛壳菌内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

探讨了液体发酵嗜热毛壳菌 (Chaetomiumthermophile)产生的内切 β 葡聚糖酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE SepharoseFastFlow阴离子层析、Pheny1 Sepha rose疏水层析、Sephacry1S 1 0 0分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的内切 β 葡聚糖酶。经 1 2 5 %SDS PAGE和凝胶过滤层析法分别测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为 6 7 8kD和6 9 8kD。该酶反应的最适温度和pH分别为 6 0℃和 4 0～ 4 5在pH5 0条件下 ,该酶在 6 0℃下稳定 ;70℃保温 1h后 ,仍保留 3 0 %的活性 ;在 80℃的半衰期为 2 5min。金属离子对内切β 葡聚糖酶的活性影响较大 ,其中Na+ 对酶有激活作用 ;Fe2 + 、Ag+ 、Cu2 + 、Ba2 + 、Zn2 + 等对酶有抑制作用。该酶对结晶纤维素没有水解能力。

嗜热毛壳菌外切葡聚糖纤维二糖水解酶的纯化和部分性质研究

研究液体发酵嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)产生的一种外切葡聚糖纤维二糖水解酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Sephacryl S-100分子筛层析、Q Sepharose Fast Flow强阴离子层析等步骤后获得凝胶电泳均一的外切葡聚糖纤维二糖水解酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法测得该酶的分子量大小约为66.3kDa和67.1kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为65℃和5.0。在60℃以下酶比较稳定,在70℃酶的半衰期为1h,在80℃下保温20min仍具有20%的活性,该酶的热稳定性较中温真菌的同类酶高,与国外报道的嗜热真菌的同类酶热稳定性接近。以pNPC为底物的Km值为0.956mmol/L。

嗜热毛壳菌纤维素酶对小尾寒羊瘤胃代谢的影响

本试验研究不同水平嗜热毛壳菌纤维素酶对小尾寒羊瘤胃代谢的影响。试验动物为4只安装有永久性瘤胃瘘管的成年小尾寒羊公羊(平均体重为45 kg),采用4×4拉丁方试验设计,在基础日粮中分别添加0％、0．3％、0．6％和0．9％4个水平酶制剂,采集瘤胃液测pH值、氨氮浓度和挥发性脂肪酸(VFA)浓度。试验结果表明:各组试羊瘤胃液平均氨氮浓度的变化范围为10．01-12．80 mg/dL,各组之间相同时间点差异不显著(P>0．05)。瘤胃液平均pH值在6．50-6．80范围内变动,试验组pH值低于对照组(P<0．05),以0．6％水平较好。各组试羊瘤胃乙酸、丙酸及总 VFA浓度的变化规律基本相同,即喂料后逐渐上升,其中乙酸和总VFA浓度在2 h后达到最高点,丙酸浓度在4 h 达到最高点,随后平稳下降于饲喂前降至最低点,再次采食后又重复出现此规律。试验组瘤胃乙酸和总VFA浓度显著或极显著高于对照组(P<0．05或P<0．01),以0．6％水平组最高。

嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)液体发酵产生纤维素酶及酶学性质的研究

探讨了嗜热真菌Chaetomiumthermophile产生纤维素酶的液体发酵条件及滤纸酶(FPA)的特性。采用液体发酵培养法 ,通过对碳源、氮源、培养时间、培养基的起始 pH值及产酶过程中 pH值和蛋白质含量变化的研究发现 :在 2 %纤维素、1%可溶性淀粉为碳源 ;2 .0 %KNO3+0 .2 %酵母粉为氮源 ;起始 pH值为 6 .5 ,5 0℃下培养 9d后 ,各种酶活最高。发酵过程中 ,pH值和蛋白质的含量均在前 3d下降 ,后升高。FPA的反应最适温度和 pH值分别为 6 0℃和 5 .5～ 6 .0 ;

嗜热毛壳菌纤维素酶活力测定及稳定性研究

本试验用绵羊瘤胃液分别处理嗜热毛壳菌纤维素酶和对照酶,对其稳定性进行研究。试验结果表明,经绵羊瘤胃液处理1h和6h后,嗜热毛壳菌纤维素酶酶活力分别为原活力的88.41%和74.04%,而对照酶酶活力分别为原活力的58.30%和46.64%。从整体来说,嗜热毛壳菌纤维素酶在绵羊瘤胃中稳定性优于对照酶。

一株嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性

研究了液体发酵嗜热毛壳菌Chaetomium thermophile产生的β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose 疏水层析、Sephacryl S-100分子筛层析等步骤后获得凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法分别测得该酶的分子量大小约为78.4kDa和81kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为60℃和4.5-5.0。有较好的酸稳定性和热稳定性。金属离子对β-葡萄糖苷酶的活性影响较大, 其中Ca2+对酶有激活作用, 而Ag+、Cu2+ 、Hg2+对酶有显著的抑制作用。该酶对水杨苷具有很强的底物特异性。

嗜热毛壳菌纤维酶对肉鸡消化道酶活性影响的研究

试验旨在研究嗜热毛壳菌纤维酶对肉鸡消化道酶活性的影响。选用1日龄健康AA肉仔鸡120羽,随机分成4组,即对照组和试验1、2、3组,分别添加嗜热毛壳菌纤维酶0、0.05%、0.15%和0.25%。结果表明,试验2和3组十二指肠(P<0.05)和空肠胰蛋白酶、胃蛋白酶的活性(P<0.01)以及十二指肠、空肠和胰脏脂肪酶的活性(P<0.05或P<0.01)显著或极显著高于其他各组,对淀粉酶的活性无显著影响(P>0.05)。

嗜热毛壳菌多糖单加氧酶的性质及协同作用研究

多糖单加氧酶(polysaccharide monooxygenases, PMOs)可以氧化裂解纤维素,为纤维素酶提供更多的结合位点,对提高纤维素酶的活性具有重要意义。本研究旨在探索嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)AA9家族PMO5456的氧化方式,以及与不同类型纤维素酶的协同作用。通过对PMO反应产物进行鉴定,确定PMO5456具有C1、C4、C6位氧化。设置时间梯度,以PMO5456预处理的磷酸膨胀纤维素(PASC)为底物,测定PMO5456与嗜热毛壳菌三种纤维素酶EG1、CT2、CBH1的协同作用,结果显示随着PMO5456预处理纤维素时间的增加,纤维素酶的活性随之增加。PMO5456对三种纤维素酶EG1、CBH1、CT2的降解效率分别提高了3.6、2.2倍和60%。

嗜热毛壳菌基因组密码子偏好性研究

嗜热毛壳菌具有强大的木质纤维素降解能力,将其开发为优异的重组蛋白表达宿主有着广阔的应用前景。蛋白表达宿主的密码子偏好性对重组蛋白的表达水平具有重大影响。为确定嗜热毛壳菌中密码子的使用模式及影响因素,本研究以6897条CDS序列为对象,对其进行密码子偏好性分析。结果显示,嗜热毛壳菌中GC3的平均含量为66.2%,高于GC1(59.1%)和GC2(45.6%)的平均含量。Effective number of codon(ENC)分析与中性绘图分析结果显示,自然选择是影响嗜热毛壳菌密码子偏好性的主要因素。相关性分析结果显示,芳香族氨基酸比例与GC1含量及蛋白疏水水平呈极显著相关,说明密码子第一位的碱基组成对氨基酸是否具有芳香性影响较大。此外,在嗜热毛壳菌使用频率较高的密码子中,有24个以G/C末端结尾的密码子,进一步确定了23个高表达优越密码子和1个高表达最优密码子(CGC)。通过与其他模式真菌的密码子偏好性进行比较发现:与嗜热毛壳菌在密码子使用频率上差异较小的为嗜热毁丝菌、粗糙脉孢霉,有显著差异的为酿酒酵母。本研究为在嗜热毛壳菌中异源表达重组蛋白提供了目标基因密码子优化的理论依据,为嗜热毛壳菌在基因组水平上的应用和研究提供了数据支撑,有助于开发高效嗜热丝状真菌表达系统应用于工业酶制剂的生产。

嗜热毛壳菌锰超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质

目的克隆嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)锰超氧化物歧化酶(CtMnSOD)基因,进行毕赤酵母真核表达、纯化重组CtMnSOD蛋白,并分析其酶学性质。方法提取嗜热毛壳菌总RNA,根据CtMnSOD基因全长编码序列(登录号为EF569987)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pPIC9K载体,重组质粒pPIC9K/CtMnSOD经SacⅠ线性化后,采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,并加入甲醇诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;重组CtMnSOD经硫酸铵沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化;并通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法测定酶学性质。结果 RT-PCR扩增产物约为684 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pPIC9K/CtMnSOD构建成功。SDS-PAGE结果显示,经甲醇诱导获得约22.7 k Da的可溶性重组蛋白。酶活力分析结果表明,工程菌酶活力达906.23 U/ml;该重组酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.0;在70℃的条件下保温30 min后仍具有71%的酶活力。结论 CtMnSOD在毕赤酵母中高效分泌表达,该酶具有较高的热稳定性,具有较好的工业应用价值。

嗜热真菌纤维素酶的CBD与海栖热袍菌的纤维素酶融合表达

将嗜热真菌毛壳菌纤维素酶Cel7A的纤维素结合结构域编码区与极端嗜热厌氧菌海栖热袍菌的纤维素酶CelB基因进行融合,构建重组质粒pHsh-CBD-CelB,并在大肠杆菌中表达。对融合蛋白进行纯化,通过热处理和离子交换层析,纯化到的融合蛋白SDS-PAGE电泳图谱显示为单一条带。对融合蛋白的特性研究,结果表明融合蛋白降解CMC的最适反应温度为90°C,结晶纤维素吸附实验表明该融合蛋白具有结合结晶纤维素的能力,并且融合蛋白降解CMC与结晶纤维素的能力得到提高。