嗜热玫瑰红球菌嗜热脂肪酶的重组表达与酶学性质研究

嗜热脂肪酶能克服常温酶生物学性质不稳定的缺陷,在工业应用中有较大的优势,因而成为最近研究的热点。通过合成嗜热玫瑰红球菌Thermomicrobium roseum DSM 5159中的预测脂肪酶基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,并对该酶进行分离纯化和酶学性质表征。重组脂肪酶的熔融温度T m和焓变ΔH分别为97.53℃和1637 kJ/mol,二级结构由56.3%α-螺旋、4.3%β-折叠、19.9%β-转角和20.3%的无规则卷曲组成。以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物时,脂肪酶最适反应温度为85℃,最适反应pH为8.5,在80℃孵育12 h后酶活力保留率在80%以上,具有良好的热稳定性;脂肪酶对实验中大部分有机溶剂具有较强的耐受力;K^(+)和Ca^(2+)对酶活力有促进作用;动力学研究证实以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物时,亲和力最高,米氏常数K m为0.01 mmol/L,催化常数k cat为3.0 s^(-1),k cat/K m为299.0 L/(mmol·s)。研究结果有助于更好地了解嗜热菌脂肪酶的基因和酶学性质,为其在生物柴油合成、洗涤剂及高温环境工业等多领域的应用奠定基础。

Arg54保守位点对嗜热玫瑰红球菌肌氨酸氧化酶的底物适应性和催化效率的影响

嗜热玫瑰红球菌肌氨酸氧化酶(thermophilus sarcosine oxidase,TrSOX)是一种N-甲基脱除酶,对底物具有特异的手性选择性并且对高温和有机溶剂具有良好的耐受性。在同源家族中,Arg54是催化中心严格保守的5个残基之一,为了研究该位点对酶学性质的影响并筛选出具有良好催化效率的突变体,在预先构建的木糖诱导质粒pMA5-Pxyl-trsox中进行Arg54位点的定点饱和突变,并将得到的质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行表达。在19个突变体中,共有15个突变体可以表达并进行制备,其中几乎所有突变体的粗酶液蛋白含量相较野生型TrSOX都有所降低,只有R54D提高约2.5倍。所有突变体都保持了优异的热稳定性,除R54Q、R54N、R54K、R54D和R54V外,其他大多数突变体的二级结构组成均受到一定影响。突变体对底物的手性特异性与野生型TrSOX相同,能特异性识别N-甲基-L-氨基酸类底物,并能将甲基脱除。R54D和R54K对N-甲基-L-氨基酸类底物的催化效率显著提高,而其他突变体的催化效率降低甚至完全失活。此外,包括R54P、R54K和R54I在内的一些突变体能够识别新的非氨基酸相关底物,如1,2,3,4-四氢异喹啉、1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉、己内酰胺、2-甲基哌啶、哌啶和(3S)-(+)-3-(甲氨基)吡咯烷等,拓展了TrSOX的底物适应性。