分子伴侣共表达对嗜热环糊精葡萄糖基转移酶异源可溶性表达的影响

【目的】通过优化表达条件,提高嗜热环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的可溶性表达和胞外酶活性。【方法】构建含cgt基因的重组表达质粒p ET-28a(+)-omp A-cgt,筛选最适诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(p KJE8、p KJE7、p Gro7、p Tf16和p G-Tf2,5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒p ET-28a(+)-omp A-cgt共表达),筛选最适分子伴侣质粒,优化共表达条件。【结果】通过SDS-PAGE分析和测定胞外酶活,CGTase基因在大肠杆菌中实现表达,且具有一定量的重组CGTase分泌至胞外;25°C诱导时CGTase的可溶性表达和在胞外上清中的酶活都最高;分子伴侣质粒p KJE8使酶的胞外活性提高了48.6%,效果最为显著;当L-阿拉伯糖浓度为0.5 g/L时,分子伴侣质粒p KJE8使酶的胞外活性提高了68.5%。【结论】通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达和胞外酶活,为该酶进一步相关研究奠定了基础。

β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株02-5-71的选育及发酵条件研究

应用氮离子注入对嗜碱芽孢杆菌进行诱变育种,获得了产生β-环糊精葡萄糖基转移酶是出发菌株2倍以上的高产菌株,酶活力可达6000U/mL以上.应用正交实验法筛选出最优发酵条件.

β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株MS-UD2的选育及产酶条件的研究

采用紫外线、硫酸二乙酯和UV+DES复合诱变,对一株产环糊精葡萄糖基转移酶的嗜碱芽孢杆菌IS进行诱变育种,获得了产酶能力是出发菌株2.96倍且产酶性能稳定的高产菌株MS-UD2,并利用单因素分析和正交试验获得突变株的最佳产酶培养基组成为:玉米粉2.0%、玉米浆6.0%、K2HPO4 0.15%、MgSO4·7H2O 0.02%;在温度28℃、pH10.0、接种量8%、250ml三角瓶装液量为50ml的发酵条件下,180r/min二级摇瓶振荡培养36h产酶活力达5741.6U/ml。5L发酵罐36h产环糊精葡萄糖基转移酶活力为5920.0U/ml。

一株产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌的选育及产酶条件的研究

介绍了一种从土壤中选育一株产环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的芽孢杆菌的方法。经筛选,最终找到一株高产CGTase的菌株SC3-2,鉴定该菌株为嗜碱性枯草芽孢杆菌。通过对其产酶条件的探索,结果表明:以玉米淀粉为碳源,以黄豆粉为氮源,在pH值为6.5,30℃的条件下培养36 h,菌株所产CG-Tase的酶活力可达5 046 U/mL。

环糊精糖基转移酶(CGTase)的化学修饰

不同蛋白质修饰剂对环糊精葡萄糖基转移酶进行修饰。在一定条件下,分别用丁二酮(DIC)、苯甲酰磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)和氯氨-T(Ch-T)处理后,酶活不受影响,说明精氨酸残基、羟基、二硫键和蛋氨酸残基与酶的活力无关。用焦碳酸二乙酯(DEPC)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)和碳化二亚胺(EDC)修饰后,酶活力大幅度下降,说明组氨酸、色氨酸和羧基氨基酸为酶活力所必需。

应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达

【目的】对嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)基因进行定向进化,筛选得到胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变酶。【方法】采用易错PCR技术向环糊精葡萄糖基转移酶基因中随机引入突变,建立酶基因突变文库,筛选获得胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变体,并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。【结果】通过筛选获得CGTase胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变菌株ds-6和ep-9,其胞外α-环化活力分别是原始酶的1.72倍和2.18倍,可溶性表达量提高了1倍。序列分析表明,突变体ep-9有3个碱基发生了变化:G2005A/A2037G/T2081G,其中有2个碱基突变导致了氨基酸的改变。SWISS-MODEL数据库模拟CGTase的结构表明,2个突变氨基酸分别位于无规卷曲和β-转角/折叠之间的转角中。酶学性质测定表明:突变CGTase的β-环化比活力是原始酶的2.44倍,总环化比活力提高了34%,K_m值由4.3 g/L降低到3.74 g/L;在pH稳定性方面较原始酶有所提高。单碱基定点突变证实突变体ep-9可溶性表达水平及胞外酶活性提高的关键突变是G2005A。【结论】本试验表明:基于易错PCR技术获得嗜热芽孢杆菌CHB1的CGTase的胞外酶活和可溶性表达定向进化,G2005A突变对于提高CGTase的可溶性表达及胞外酶活起关键作用,这对认识CGTase的构效关系以及进一步改造该酶分子、扩大酶的生产应用具有重要意义。

嗜碱芽孢杆菌MS-5产环糊精葡萄糖基转移酶发酵工艺研究

目的:使环糊精葡萄糖基转移酶产生菌嗜碱芽孢杆菌MS-5适应工业化生产的需要。方法:在5L发酵罐中,研究菌株MS-5的发酵规律并根据发酵规律对发酵工艺进行优化。结果:菌体对数增长期,发酵液溶氧处于较低状态,发酵液pH持续下降;在菌体对数增长中期,pH开始回升,菌体产酶呈增长趋势,在对数增长中后期菌体产酶迅速增加;进入菌体增长稳定期后,发酵液相对溶氧迅速回升至初始状态,pH值回升至起始值,菌体产酶趋于稳定。通过有效增加菌体快速增长期发酵液溶氧,菌株产酶能力提高,产酶周期缩短了近50%。结论:应用该菌株发酵24h,产酶达到6032.5U/mL。

环糊精葡萄糖基转移酶N-端热稳定性研究

环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase;EC2.4.1.19)是生产环糊精的重要工业用酶,由于工业生产条件的高温加热,使得CGTase的使用受到很大限制。除了筛选合适菌种外,人们更希望利用蛋白质工程手段改造CGTase的热稳定性。文中采用分子动力学模拟取样研究了CGTase的N-端环状区域中氢键与盐桥对其耐热性的影响作用。结果表明:随着模拟温度的升高,非电荷-非电荷氢键占有率显著降低,带电荷-带电荷氢键占有率并没有太大变化,高温下能够保持稳定的氢键几乎都是和带电氨基酸有关;由盐桥的断裂次序的分析,发现在高温下多数盐桥的占有率并没有显著降低,即盐桥的稳定存在对于抵抗高温是有效的。无论是氢键还是盐桥,它们的相同点都是带电荷-带电荷之间的反应受温度影响不大。这一结果说明在蛋白质CGTase中合适的位置增加带电氨基酸数量,增强电荷间静电相互作用,对于提高CGTase的热稳定性是有效的。

化学添加剂提高重组α-环糊精葡萄糖基转移酶酶制剂稳定性

通过向重组α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT酶)液中添加化学添加剂以提高其热稳定性及贮存稳定性。在不同温度下研究了添加剂对酶液的贮存稳定性影响,并用圆二色谱(CD)研究了CGT酶在近紫外区和远紫外区蛋白质结构与热稳定性的变化关系。当单独加入各种添加剂在50℃水浴1 h和室温放置108 d后,发现含有20%甘油的酶液稳定性最好,与未加任何添加剂的对照酶液相比仍有91%和50%的酶活,对照酶液在50℃水浴1 h后仅有小于10%的活性,室温放置108 d后已经没有酶活。明胶、CaCl2和PEG400也有一定的保护效果。将4种保护剂分别以最佳浓度组合叠加添加到CGT酶发酵液中40℃贮存45 d,CGT酶的残酶活几乎不变,维持在100%左右。通过变温圆二色光谱分析α-CGT酶α-螺旋和β-折叠变化,发现了保护剂可以明显降低高温条件下酶的变性程度,有利于维持其二级结构及天然三维构象,使酶在高温时保持较高的酶活。化学添加剂可以明显提高α-CGT酶酶制剂的稳定性,为CGT酶的工业化应用提供稳定剂复配的方法,同时蛋白质的变温圆二色谱分析也为其他蛋白酶热稳定性研究提供了理论依据。

分子动力学模拟研究CGTase酶活性区域的热稳定性

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase,E.C.2.4.1.19)是食品、医药和化妆品等领域中的重要酶。文中通过分子动力学模拟研究了CGTase活性位点区域中分子内非共价键相互作用对蛋白质热稳定性的影响,以及在热压力下这些分子内非共价键相互作用又会如何发生变化。研究发现:在CGTase酶活性区域中分布着较多的盐桥和氢键网络体系,分析盐桥间的距离变化发现这些盐桥对高温具有很好的抗性,同时,高温下盐桥网络又比单个盐桥更加稳定;对该区域中氢键分析,发现随着模拟温度的升高,带电荷氨基酸之间形成的氢键在高温下具有很好的稳定性,同样,高温下氢键网络也比单个氢键更加稳定;通过对非共价键相互作用的分析中发现活性位点两侧的氨基酸残基与酶的热稳定性也有很大的关系。该蛋白酶的热稳定性与非共价键连接的数量、存在形式及形成非共价键相互作用的氨基酸空间位置都息息相关。该结果为用酶工程设计改造环糊精葡萄糖基转移酶热稳定性提供了突变方向,同时,为理解酶蛋白的热稳定机制,结构与功能关系的研究提供有益参考。