Caldisericum exile来源新嗜热脂肪酶的发现及酶学特征的研究

脂肪酶在进化过程中具有菌属特征,新嗜热脂肪酶的开发是脂肪酶研究和应用的重要方向。从嗜热微生物发酵产物或利用宏基因组方法分离发现新嗜热脂肪酶的操作过程较为繁琐。该文基于生物信息学方法和异源表达技术,对海洋热泉来源的Caldisericum exile基因组数据进行筛选和进化分析,发现BAL81435.1(GenBank ID)可能编码新的嗜热脂肪酶。将该序列克隆到pET28(a)载体上,诱导表达后对该酶进行分离纯化和酶学性质表征。试验证实BAL81435.1编码新的嗜热脂肪酶,其底物为长碳链(C_(12)以上)的对硝基苯磷酸酯,最适底物为C_(16)的长碳链,最适pH值为8.8,最适温度为60℃。该嗜热脂肪酶在4~60℃具有较好的温度耐受性,对大部分有机溶剂、金属离子、变性剂及高浓度的NaCl有较好的耐受性,但对表面活性剂敏感。该研究表明BAL81435.1编码新的嗜热脂肪酶,为嗜热脂肪酶的进一步开发奠定基础。

嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质

对嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilis)WF146的产蛋白酶的条件进行了研究,在58℃条件下,WF146在pH值为75的Fd培养基中振荡发酵培养48h后,发酵液中高温蛋白酶产量可达600u/mL以上。对该酶性质的研究表明,酶分子量为34kD,最适作用pH为80,最适作用温度为80℃,具有良好的pH稳定性及热稳定性。Ca2+对该酶的稳定性具有重要影响,PMSF、DFP及IAA能强烈抑制酶活力。

嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的性质

利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析 (DEAE- 2 2 )、Sephadex G- 75凝胶过滤从嗜热脂肪芽孢杆菌胞内提纯得到 β-半乳糖苷酶。研究表明 ,该酶最适表观反应温度和最适 p H分别为 6 0℃和 6 .4。在 50℃该酶具有良好的热稳定性。碱金属和碱土金属盐对酶有激活作用 ,重金属 Zn2 +、Fe3 +、Cu2 +抑制酶的活力。巯基保护剂能明显增强酶的活力 ,而巯基结合试剂强烈抑制酶的活性。该酶对 β- D糖苷键具有高度专一性 ,与糖苷键相连的配基对酶活力也有很大影响。在 55℃ ,酶作用于底物 ONPG和乳糖的米氏常数 Km分别 2 .6 3mmol/L和 4 .93mmol/L,最大反应速度分别为 1.93× 10 -5mmol.min-1.mg-1protein和 6 .54× 10 -5mmol.min-1.mg-1protein。乳糖的水解产物葡萄糖抑制酶活力 ,其抑制常数 2 .4 7mmol/L ,但半乳糖没有这种效应。另外 ,该酶具有转半乳糖苷的活力 ,在水解乳糖过程中 ,生成包括三、四糖的半乳糖低聚糖。

嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因perA在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术得到嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillusstearothermophilus)过氧化氢酶基因 perA ,将该基因与表达载体 pKK2 2 3 3连接构建重组质粒pK perA ,转化大肠杆菌过氧化氢酶HPⅠ和HPⅡ双缺突变株UM 2 ,得到重组大肠杆菌UM 2 1.酶活测定结果表明 ,表达产物具有正常的生物学活性 .SDS PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达条带 ,单体Mr =86× 10 3 ,与嗜热脂肪芽孢杆菌所产酶相同 .实验表明 ,重组质粒在宿主UM 2中有较好的稳定性 ,在无选择压力条件下传代 6 0次基本保持稳定 ,传代 10 0次重组质粒保留 80 %以上 .摇瓶实验确定重组菌的最佳表达条件为 :IPTG浓度 ,0 .75mmol/L ;诱导时间 3h ;培养基起始 pH 6 .5 ;诱导温度 37℃ ;装液量 5 0mL/ 2 5 0mL .在优化条件下 ,重组菌产生的过氧化氢酶占菌体总蛋白的 8% ,酶活力可达 35U/mL ,是原始菌株BacillusstearothermophilusIAM110 0 1的 11.7倍 .图 2表 1参

表面活性剂对嗜热脂肪芽孢杆菌产高温蛋白酶的影响

研究了表面活性剂对嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)WF146产胞外高温蛋白酶的影响。结果表明,表面活性剂Tween80在0.05%～0.1%(体积比)浓度范围内对WF146产酶有一定的促进作用。在培养基中添加0.1%Tween80可使发酵液酶活提高12.7%,Tween20和TritonX100则抑制嗜热脂肪芽孢杆菌WF146产酶。另外,TritonX100抑制嗜热脂肪芽孢杆菌WF146生长,而Tween80和Tween20不抑制其生长。

瞬时高压对嗜热脂肪芽孢杆菌的杀灭效果

本文研究了不同作用压力和处理次数下瞬时高压(IHP)对嗜热芽孢杆菌的杀灭效果,以及食品基质对IHP杀菌的影响。结果表明:①瞬时高压作用对嗜热芽孢杆菌具有较好的杀灭效果,随着处理压力的提高,嗜热芽孢杆菌的致死率上升;提高进料温度,嗜热芽孢杆菌的致死率略有升高。进料温度10、25、40℃下分别处理一次时,随着处理压力从80MPa上升到120MPa,对嗜热芽孢杆菌的致死率分别从54.13%、53.81%、54.39%上升到74.12%、74.52%、74.96%。②瞬时高压对嗜热芽孢杆菌的致死率随着处理次数的增加而上升,且增加处理次数比提高作用压力的效果要好的多。室温(25℃)下,采用在100、110、120MPa下分别对样品处理3次,100MPa下处理三次的致死率分别为67.6%、74.13%、77.95%,110MPa下分别为71.34%、76.89%、80.74%,120MPa下分别为74.52%、79.58%、82.08%。③食品基质对瞬时高压下的菌体有保护作用,在一定浓度范围内,基质浓度愈高,对菌体保护作用愈强。在菌液中添加消毒豆奶,浓度为0、1.5、3、4.5、6g/100g,进料温度为25℃,工作压力分别为100、110、120MPa进行瞬时高压处理。结果100MPa下对菌体的致死率从67.60%下降到65.73%,110MPa下从71.34%下降到69.12%,120MPa下从74.52%下降到72.36%。

嗜热脂肪芽孢杆菌对超高压的耐性初探

对嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）Asl．999进行了超高压杀菌实验，探讨压力、时间、基质对灭菌效果的影响，并考察了热处理和抑菌剂对高压杀菌的协同作用效果．

固定化嗜热脂肪芽孢杆菌合成低聚半乳糖

利用海藻酸钙、明胶和壳聚糖为固定化载体包埋嗜热脂肪芽孢杆菌细胞合成低聚半乳糖 (GOS)。通过比较三种方法的酶活力回收、最适反应条件、GOS的得率和和载体机械强度 ,选择明胶作为固定化细胞的载体。反应体系的温度、pH、乳糖浓度、乳糖的转化率和载体的传质阻力对GOS合成有明显影响。在CSTR反应器中水解 60 %乳糖 ,GOS最大得率为31 2 % ,经过 96h( 8批反应 ) ,产物得率为原来的 88%。在空速 0 0 9h- 1条件下 ,利用填充床反应器连续水解乳糖 ,GOS的得率和反应器生产能力分别为 31 5%和 1 7 4g (L·h) ,连续反应1 40h,GOS得率下降 2 0 %。产物经过活性炭柱层柱分离纯化 ,通过13C NMR鉴定四糖的化学结构为 β D Gal ( 1→ 3) D Gal ( 1→ 6) D G ( 1→ 4) D Glu。

嗜热脂肪芽孢杆菌HY-69耐热金属蛋白酶基因表达产物的纯化及性质研究

利用ＣＭ纤维素离子交换层析法，从宿主细胞枯草芽孢杆菌ＭＩ１１３中纯化了嗜热脂肪芽孢杆菌ＨＹ６９的耐热金属蛋白酶基因的表达产物，达电泳纯。该酶的最适反应温度为７０℃，有着较好的热稳定性和极高的盐酸胍抗性。７０℃的半寿期为４５ｍｉｎ。在３ｍｏｌ／Ｌ的盐酸胍中变性２０ｍｉｎ，仍残余近４０％的酶活。利用凝胶过滤和ＳＤＳＰＡＧＥ，测定其分子量均为２７０００±１０００。通过ＣＤ光谱得知，该酶含有６６％的α螺旋，２８％的β转角，６％的无规则卷曲，无β折叠。利用ＣＤ光谱和荧光光谱研究了该酶在盐酸胍变性过程中的构象变化，推测其主要是通过增加包装效率，减少无规则卷曲来提高酶的稳定性。

热压协同对嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢灭活动力学的研究

研究了热压协同(500～600MPa,80～90℃)对嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在磷酸缓冲液和牛奶(经超高温灭菌)中灭活的动力学规律,并对超高静压的升压过程及相应的灭活效果进行了研究。结果表明,升压过程对嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢灭活的影响不能忽略,且随压力增加这种效果越强,最高使其下降1·23个数量级;嗜热脂肪芽孢杆菌在牛奶中比在磷酸缓冲液中有更高的抗性;在3种拟合模型(线性、Weibull和Log-logistic模型)中,线性模型不适合模拟这些存活曲线,而Log-logistic模型能更好地模拟这些存活曲线,其次是Weibull模型。

嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长特性与培养条件研究

目的：研究嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的生长特性与培养条件。方法：以菌体生长量为主要评价指标,利用单因子试验与正交试验相结合的方法对影响CHB1生长的主要因素进行分析。结果：CHB1最低和最高生长温度分别为45℃和74℃,最佳培养温度为60℃;最低和最高起始生长pH值分别为6.5和9.0,最适起始pH为8.0;菌体生长到达对数期的时间为15-18h;接种量2%,装液量40mL,转速180r/min。结论：CHB1为高温菌,生长pH范围偏碱性,条件优化后总菌体浓度可达1.1×10^9CFU/mL。

热协同超高压对不同介质中嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的灭活作用

以磷酸缓冲液及经过人工接种的牛乳、鸡腿菇和卤牛肉为对象,考察超高压协同热处理对嗜热脂肪芽孢杆菌灭活的影响,测定处理前后的细菌菌落总数。结果表明,嗜热脂肪芽孢杆菌的失活率依次为:牛乳>磷酸缓冲液>鸡腿菇>卤牛肉。处理组500/60℃、500/90℃、600/80℃,5min、10min,牛乳中失活率(-2.18,-2.82,-3.32)高于磷酸缓冲液中的失活率(-1.62,-2.78,-2.98);卤牛肉中的失活率低于鸡腿菇中的失活率。说明在热协同超高压杀灭嗜热脂肪芽孢杆菌过程中,牛乳中存在利于诱导芽孢发芽的物质,使芽孢失去原有的对热的抵抗力,而在鸡腿菇和卤牛肉中失活率较牛乳低是由于其水分活度较低,卤牛肉中的失活率低于鸡腿菇中的失活率是由于NaCl对芽孢有保护作用,增加了其对压力的耐受性。

嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1发酵培养基的优化

以菌体生长量和pH值作为培养基优化的指标,对嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1发酵培养基成分进行了筛选与优化。结果表明,不同碳氮源对发酵液菌数影响相差较大,最佳培养基配比为:牛肉膏、大豆蛋白胨、NaCl、K2HPO4和KH2PO4;最佳摇瓶发酵配方为:牛肉膏0.5%,大豆蛋白胨0.9%,NaCl 0.2%,K2HPO4∶KH2PO4为0.1%∶0.075%,该培养基中培养CHB1比在发酵基础培养基中培养菌量提高10倍以上。

嗜热脂肪芽胞杆菌生产1,6-二磷酸果糖的研究

研究了嗜热脂肪芽胞杆菌发酵生产 1,6 -二磷酸果糖 (FDP)的工艺条件和工艺特点。采用活化培养工艺 ,改变菌体细胞透性和生理状态 ,获得高产率的 FDP发酵液 (产量为 6 0 m g/ ml)。本法生产 FDP具有副产物少 ,转化率高 。

嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1固体发酵工艺

以菌量为指标,以麸皮、豆粕为基本发酵原料,通过单因素试验与正交试验,对嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1固体发酵培养基与培养条件进行优化。结果表明,CHB1最佳固体发酵工艺为:250mL三角瓶中装麸皮11.3g,豆粕3.7g,pH8.0磷酸缓冲液润湿混匀,含水量50%,接种量15%(V/m),55℃,培养24h,菌量达8.12×108CFU·g-1,比优化前提高8倍以上。通过对CHB1固体发酵工艺的优化,可实现CHB1高密度培养,降低CHB1生产成本,提高其在堆肥化中的作用效果。

嗜热脂肪芽孢杆菌耐热β-半乳糖苷酶功能位点的累积进化研究

针对嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源耐热β-半乳糖苷酶Bga B底物结合位点构建突变体,研究底物结合位点累积突变的功能进化及水解活性的变化规律。实验结果表明:Y272A与E351R的累积突变体比酶活为野生型酶的3.67倍,为单点突变体Y272A的2倍;Y272A/E351R突变体的Km值增大,其对乳糖的亲和力下降,但由于Kcat值增大,使累积突变体Y272A/E351R催化效率提高为野生型酶催化效率的7.8倍。本研究结果表明底物结合位点间的累积突变可改变底物亲和性,并对水解催化活性进化起到正向促进作用。

嗜热脂肪芽孢杆菌A-10'对马铃薯植株生理生化指标的影响

马铃薯脱毒苗经环腐病菌悬液浸根后,再用A-10'生防菌液处理,结果表明:叶片内的苯丙氨酸解胺酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)和叶绿素的含量与对照相比均有明显的增加,表明植物的抗病性增强;可溶性蛋白的释放减少,表明降低了病菌对组织的破坏作用,说明嗜热脂肪芽孢杆菌对马铃薯植株的抗病性具有诱导效应。

嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的5L发酵罐发酵条件初探

优化嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的5 L发酵罐发酵条件。通过单因素法优化发酵罐的通气量、转速、温度、pH等参数,并测定CHB1在5 L发酵罐中的生长曲线。结果表明,最佳发酵条件为:转速180 r/min、通气量6 L/min、发酵温度58℃、接种量4%,发酵过程自动流加乙酸控制pH值为8.0,培养21 h。采用自动流加乙酸控制pH值的方法,效果显著,控制pH值为8.0时,发酵效果最好,细胞生物量高达6.07×108cfu/mL,约是不控制pH值发酵的对照组(3.5×108cfu/mL)的2倍。

嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶分解毛发角蛋白的研究

本文研究了嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillusstearothermophilus)WF - 1 4 6高温蛋白酶对毛发角蛋白的水解作用。结果表明 ,在体积分数为 2 %的巯基乙醇存在的条件下 ,WF - 1 4 6高温蛋白酶对毛发角蛋白有明显的水解作用。对酶解液氨基酸分析表明 ,酶解液中含有对照液中没有的游离蛋氨酸和亮氨酸 ,且游离氨基酸总量是对照样品的 2 .4倍 ,达 1 5 8mg·L-1 。此外 。

嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶酶学性质研究

对获得的嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶进行了酶学性质测定.结果表明：普鲁兰酶最适温度为60℃,此温度下处理90min,残存酶活在70%以上,70℃酶的半衰期大于50min;最适pH 5.6,在pH 4.5-6.0的范围50℃保温24h仍具有较高活性;Km为0.036μmol/L,Vmax为20.16μmol/min;Mn^2＋、Mg^2＋和Ca^2＋对酶有激活作用,其中以Mn^2＋的激活作用最强,而Cu^2＋和Zn^2＋则有抑制作用.研究表明嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶是高温酸性酶,对底物有较强亲合力和催化活性,在淀粉糖化工业中有良好的应用前景.