极端嗜热菌Thermus thermophilus HB8中天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为获得具有热稳定性的天冬氨酸转氨酶,从极端嗜热细菌Thermus thermophilus HB8中克隆得到天冬氨酸转氨酶基因aspC,并在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行表达,发现在Rosetta(DE3)中具有较高的表达量。重组酶的最适反应pH是7.0,37℃下在pH8～10的缓冲液中保温1h酶活几乎不改变。重组酶反应的最适温度为75℃,酶活稳定的温度范围为25～55℃。重组酶在65℃时半衰期为3.5h,75℃时为2.5h。重组酶的KmKG为7.559mmol/L,VmaxKG为0.086mmol/(L·min),KmAsp为2.031mmol/L,VmaxAsp为0·024mmol/(L·min)。Ca2+、Fe3+、Mn2+等金属离子对酶活性有微弱抑制作用。

嗜热菌Thermus thermophilus HB8铁硫簇合成途径中IscA和IscU蛋白的表达、纯化和功能研究

Fe-S簇可参与电子传递和基因调节等过程.实验以嗜热菌Thermus thermophilus HB8基因组为模板,通过PCR扩增获得Fe-S簇ISC系统生物合成途径中的IscA和IscU基因,并克隆连接到表达载体pET-28a(+)上.重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3)进行表达,用亲和层析纯化得到浓度和纯度都较高的IscA和IscU蛋白.SDS-PAGE分析,证实其分子量大小分别为13.7KD和14.8KD.实验确定IscA是单聚体,IscA上能形成铁硫簇,IscU上不能形成铁硫簇.在厌氧条件下,RNA的量能提高1.5倍,但是IscA和IscU的表达量都会降低,说明厌氧对这两个基因有损伤.

嗜热菌Thermus sp.YBJ-1的分离和淀粉酶基因的克隆

从西藏热泉水样分离得到一株嗜热菌 (YBJ 1) ,其 16SrDNA(15 11bp)序列与栖热菌 (ThermusscotoductusITI 2 5 2T)的同源性为 98%。通过PCR技术将Thermussp .YBJ 1的淀粉酶基因 (amyT)全长开放阅读框克隆到T载体。分析表明 ,amyT的ORF全长为 176 7bp ,编码 5 88个氨基酸。推导的氨基酸序列与嗜热脂肪芽孢杆菌的阿尔法环糊精酶 (Bacillusstearothermophilusalpha cyclodextrinase)和栖热菌Thermussp .IM6 5 0 1的麦芽糖淀粉酶 (Thermussp .IM6 5 0 1maltogenicamylase)分别有 99%和 96 %的同源性 ,与嗜热脂肪芽孢杆菌的新普鲁兰酶 (neopullulanase)的同源性为81%。

极端嗜热菌Thermus thermophilus HB27中天冬氨酸激酶在大肠杆菌中表达、纯化及酶学性质研究

为获得具有热稳定性的天冬氨酸激酶,从极端嗜热菌Thermus therm ophilus HB27基因组中扩增出天冬氨酸激酶(AK)基因,构建重组质粒,并在Escherichia coliBL21(DE3)中进行表达,得到了较高的表达量。经热处理纯化后测定重组天冬氨酸激酶(tAK)的最适pH为7.5,最适反应温度为80℃,80℃半衰期是18 h。酶动力学分析表明tAK的KmATP为0.23 mmol/L,Vm axATP为840.34 nmol/(L.m in),KmAsp为0.95 mmol/L,Vm axAsp为190.76 nmol/(L.m in)。赖氨酸和甲硫氨酸对tAK活性没有抑制作用,当苏氨酸浓度大于0.5 mmol/L时,对tAK活性有明显抑制作用,并且抑制作用与苏氨酸呈现浓度依赖性。

极端嗜热菌Thermus thermophilus HB27中腺苷酸激酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

目的克隆Thermus thermophilus HB27隆腺苷酸激酶基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达并获得了比较高的表达量并对其酶学性质进行分析。方法利用PCR技术从Thermus thermophilus HB27基因组中扩增得到腺苷酸激酶的基因片段,将其克隆到pET-28a表达载体上,以PCR\酶切和测序进行鉴定。利用光谱分析测定该重组酶的相关酶学性质。结果成功克隆和高效表达了腺苷酸激酶;重组酶的最适pH是8.5,最适温度是90℃。重组酶对底物ADP的米氏常数Km是68.6μmol/L,VmaxADP为0.294mmol/(L-1·min-1)。将该重组酶在70、80、90、100℃下分别作用7h后,发现仍具有酶活性,显示出高的温度耐受性。腺苷酸激酶的特异性抑制剂AP5A浓度为2.0mmol/L能够抑制重组腺苷酸激酶70%的酶活性,AP5A对重组腺苷酸激酶的抑制类型为竞争性抑制,其抑制常数为46.39μmol/L。结论成功克隆、表达重组腺苷酸激酶,为腺苷酸激酶的进一步应用奠定了基础。

Thermus thermophilus HB8葡萄糖异构酶在大肠杆菌中表达

为了增加高热稳定性的葡萄糖异构酶的得率,采用PCR技术扩增得到Thermus thermophilusHB8葡萄糖异构酶基因xylA,连接到表达载体pET-22b(+)上,获得重组质粒pET-22b(+)-xylA。将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后,通过半胱氨酸-咔唑法测葡萄糖异构酶酶活。重组菌经诱导培养,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子量约为44 kD特异性蛋白质条带,比酶活约为18.562 U/mg,比野生型菌株提高了2倍。

Thermus thermophilus木糖异构酶与木糖醇的分子对接及模型分析

Xylose isomerase from Thermus thermophilus is widely used in the production of high-fructose corn syrup and the construction of xylose via recombinant strains. In this paper, the positions of Mg ions and xylitol in 1BXB were established by structure analysis, molecular docking and computing. The Complex of 1BXB with xylitol was modeled and analyzed. Comparing the structure of 1BXB complex with 1S5N, it was found that the overall structure of them showed a high similarity. The residues around xylitol were highly conserved in xylose isomerase, and the orientation and positions of xylitol were very similar in both structures. The coordination bonds formed between Mg1 and O2 or O4 of xylitol stabilized the conformation of xylitol at the active site of 1BXB.

重组Thermus thermophilus DNA聚合酶表达纯化及其在RT-PCR中的应用

目的研究重组ThermusthermophilusDNA聚合酶的表达、纯化和应用。方法提取Thermusthermophilushb8基因组DNA作为模板,PCR扩增TthDNA聚合酶基因后,克隆至pET28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,用His-BindQuickCartridge300纯化重组TthDNA聚合酶His-tag融合蛋白。提取Thermomonosporafusca总RNA,用一管法RT-PCR扩增E2cd基因,检测重组TthDNA聚合酶RT-PCR活性。结果大肠杆菌表达TthDNA聚合酶,分离出的电泳纯重组TthDNA聚合酶His-tag融合蛋白相对分子质量为94000,表达产量为200000U/L。一管法RT-PCR可扩增出850bp长度的E2cd基因。结论重组TthDNA聚合酶已成功地表达和纯化,并用于RT-PCR。

水生栖热菌Thermusaqu aticus FL-03嗜热麦芽糖转葡萄糖基酶基因的克隆及表达

以水生栖热菌FL-03菌株的基因组DNA为模板,PCR扩增编码嗜热麦芽糖转葡萄糖基酶的基因(MalQ)片段,克隆至pET-28a(+)原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。重组蛋白经70℃钝化离心除杂蛋白后,经SDS-PAGE检测,可见单一条带。纯化酶液以10%麦芽糖为底物,经TLC法分析表明该酶具有转葡萄糖基的活性,比活力提高近5倍,且活力回收率达70%,具有重要的工业应用前景。

双交换同源重组法构建Thermus thermophilus基因无痕敲除突变体

为在噬热栖热菌(Thermusthermophilus)中开収无需筛选标记的基于双交换同源重组的基因无痕敲除手段,以大质粒及染色体上的TTP0042与TTC0340_0341为靶基因,构建含有其两侧同源臂的基因敲除载体幵转化T.thermophilusHB27细胞,将转化混合物涂布于不含筛选物质的培养基上,通过PCR及Southern杂交检验转化子的基因型。结果表明,采用线状的TTP0042基因敲除载体迚行转化,获取表观Δ0042突变体的概率为10–4,而使用闭合环状载体,该概率可达10–3;基因型及表现型分析显示,这些表观Δ0042均为TTP0042无痕敲除型突变体。该敲除手段在染色体上的基因TTC0340_0341中得到验证,从300个单菌落中成功鉴定出了1个Δ0340_0341突变株。

中度嗜热菌Leptospirillum ferrooxidans和Acidithiobacillus caldus对砷的耐受性研究

以难处理金矿生物预氧化过程中使用的L.ferrooxidans(Leptospirillum ferrooxidans,氧化亚铁钩端螺旋菌)和A.caldus(Acidithiobacillus caldus,喜温嗜酸硫杆菌)这2种中度嗜热菌为主要研究对象,通过摇瓶实验研究不同价态的砷[As(Ⅲ)和As(Ⅴ)]对2种中度嗜热菌生物氧化处理金矿效果的影响,并与A.ferrooxidans(Acidithiobacillus ferrooxidans,嗜酸氧化亚铁硫杆菌)和T.thiooxidans(Thiobacillus thiooxidans,氧化硫硫杆菌)这2种嗜中温菌进行比较。结果表明,中度嗜热菌对As(Ⅲ)的耐受性明显弱于嗜中温菌,但对As(Ⅴ)的耐受性与嗜中温菌接近。同时,As(Ⅲ)对铁氧化细菌生长的影响大于硫氧化细菌。实验发现,提高菌种接种量并对细菌进行驯化有利于中度嗜热菌对砷毒性的适应,在实际矿浆体系中通过提高接种量可以使中度嗜热菌最终适应高砷环境,最高质量浓度可达约1.54 g/L,获得较好的矿物氧化浸出效果,砷浸出率达到70%以上仅需10 d。

超嗜热菌对乡村有机固体废弃物发酵过程减量化的影响研究

传统发酵在废弃物资源化处理中已经广泛应用,但是存在发酵周期长、发酵温度低、容量大、水分高、减量化效果不佳等缺陷。采用超高温好氧发酵技术对乡村有机固体废弃物进行处理,将超高温环境下培养出的以芽孢杆菌(Bacillus)为核心的超嗜热菌剂添加到有机固体废弃物中,采用高通量测序技术,对堆体不同阶段的微生物种群进行分析,同时,对堆体温度、含水率、碳氮比(C/N,质量比)、pH、种子发芽指数(GI)和电导率(EC)等指标进行分析。结果表明:堆体的最高温度为86℃,以80℃为节点,发酵超高温期占比达到2/3,含水率从44.57%下降到29.09%,总减重率和总减容率分别为85.50%、50.51%,发酵结束时C/N、pH分别为15.56、7.55,发酵结束时物料的GI和EC分别为110.24%和3.72 mS/cm,发酵过程中芽孢杆菌目(Bacillales)和放线菌目(Actinomycetales)是达到堆体减量化效果的主要菌目。综上所述,超嗜热菌对好氧堆肥有一定的促进作用,是乡村固体废弃物减量化处理较为理想的发酵菌剂。

湿垃圾高温好氧堆肥处置过程中嗜热菌的应用及研究进展

目前,湿垃圾的无害化处理越来越受到重视,我国湿垃圾的主要处置方式从焚烧和填埋逐渐发展到微生物发酵,其中,好氧堆肥能够有效处理农业废弃物、厨余垃圾以及厌氧发酵存留的沼渣,是多数湿垃圾处置的最终归宿。近年来,随着小型堆肥设施的发展和普及,高温好氧堆肥逐渐成为主流的堆肥方式。相较于传统自然堆肥,高温好氧堆肥技术通过额外添加高温菌剂及其他辅助手段,显著提升了堆肥的温度及其持续时间,有效提高了堆肥质量。优良的高温降解菌的筛选和菌剂配制是高温好氧发酵技术发展的前提。目前,在湿垃圾高温好氧堆肥中,常用的菌种包含各种放线菌、芽孢杆菌、假单胞菌和乳酸菌等。使用不同菌种复配的高温菌剂能够明显延长高温持续时间,提升堆肥中不同组分的降解效率,有效减灭堆肥样本的有害性,使之成为能够二次利用的优良有机腐殖质。本文阐述了目前我国湿垃圾的概况、湿垃圾现有的处置方式、嗜热菌的种类及筛选、高温好氧堆肥的技术特点以及发展趋势等,初步讨论了目前湿垃圾转化面临的机遇与挑战,为湿垃圾的无害化、资源化处理提供一些有价值的参考意见。

Thermus thermophilus HB27质粒分离基因位点同系物parATth的功能研究

通过敲除噬热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27的parATth基因,获取parATth基因敲除突变体,并从染色体DNA的复制及子细胞分离等方面分析突变体的表现型,鉴定parATth的功能。结果显示:在parATth突变体中,未出现明显的细胞生长与分裂受阻现象,细胞形态也未发生变化;与野生株相比,突变株染色体DNA的拷贝数未发生变化,大区段染色体DNA的子细胞分离也未受阻,但染色体的复制起始位点(oriC)区域的亚细胞定位受到影响,其定位于细胞任意位置。综合分析,T.thermophilus HB27的parATth基因在大区段染色体DNA的子细胞分离过程中没有起关键作用,但其可能参与染色体复制起始位点区域的子细胞定位与分离。

一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性

从油田地层水中分离到一株嗜热并高效降解苯酚的BF80菌株,其最适生长和降解苯酚的温度为60℃65℃。利用API50CHB/E系统和16SrDNA序列分析对菌株BF80进行了分类鉴定,该菌株的形态和生理生化特性与Geobacillusthermoglucosidasius基本相同,其16SrDNA序列与GeobacillusthermoglucosidasiusBGSCW95A1(=ATCC43742)的相似性为99·22%。在接种量为1%的条件下,该菌在20h内能完全降解3mmol/L的苯酚;在pH值5·59·0范围内能保持对苯酚良好的降解能力,并在12mmol/L苯酚的无机盐培养基中也能生长和降解苯酚,表明该菌能耐受高浓度苯酚并可用于高温含酚废水的生物处理。

一个产生L-乳酸脱氢酶的嗜热菌的新种——非解朊栖热菌

从广东省阳江、电白和韶关等地55—95℃的温泉中采集水样,经分离得到21株 G^-、不产生芽孢的高温菌。它们都能产生 L-乳酸脱氢酶。根据表观特征,DNA 的同源性和 G+Cmol%等特征可归入栖热菌属(Thermus)。但对葡萄糖不产酸和不液化明胶等表型特征不同于已发表的种。又根据该群内的 DNA/DNA 杂交结果,有高的同源性(大多在80%以上),而与已发表的种仅有40.5—70.7%的同源性。结果表明可成立一独立的类群,建议为栖热菌属的一个新种,因具不液化明胶的特性,命名为非解朊栖热菌(Thermus nonproteolyticus Cai & Yangsp.nov.)。以菌株 HG-42为模式株,保藏于中国科学院微生物研究所。

嗜热菌——工业用酶的新来源

综述了嗜热菌和极端嗜热菌产生的热稳定性的淀粉酶、纤维素酶、环糊精酶、木聚糖酶、几丁质酶、葡萄糖异构酶、蛋白酶等的研究进展及其在食品、化工、环保等方面的应用前景。

温度对厌氧嗜热菌群产甲烷能力的影响

为提高厌氧发酵的效率,实现沼气发酵的可控化,采用序批次反应器来研究嗜热性微生物菌群在不同温度条件下对不同底物产甲烷潜力的变化规律.玻璃反应器(108 mL)中分别加入8 mL嗜热微生物菌群和0.5 mL的底物(乙酸或丙酸)以及31.5 mL的营养液,然后放置在9个不同处理温度(25～65℃)的生化培养箱中进行培养.反应器中甲烷的产量用气相色谱(Shimadzu GC-8A)来分析和测定.结果表明,当以乙酸作为底物时,该嗜热菌群的甲烷最大生产率在各处理温度都要高于以丙酸作为底物时平行样的产气率;试验所用嗜热菌群的最佳产气温度为40℃和55℃;在低温(≤30℃)和高温(＞60℃)条件下,该菌群表现为极低的产气率,同时表明该菌群对此温度范围极为敏感.

用嗜热菌蛋白酶进行人肠上皮细胞分离培养

目的 探讨人肠上皮细胞 (intestinalepithelialcell,IEC)的分离、培养及鉴定方法 ,为进一步研究IEC提供合适的细胞模型。方法 取 4～ 6个月合法引产胎儿小肠 ,用嗜热菌蛋白酶消化分离IEC ,接种于含多种促IEC生长的营养成分的DMEM培养液内 ,根据IEC和成纤维细胞贴壁时间的差异来纯化IEC ,通过观察IEC生长状态、形态特征、超微结构及检测上皮细胞膜抗原对IEC进行鉴定。结果 嗜热菌蛋白酶消化 2h可分离出大量的健全绒毛隐窝单位 ,进一步培养获得的IEC ,上皮细胞膜抗原均呈阳性。结论 选用嗜热菌蛋白酶作为分离IEC的消化酶 ,可获得较纯的IEC ,完全可供相关实验研究之用。

嗜热菌的筛选及菌种的初步鉴定

从自然堆肥中分离嗜热细菌 ,通过纯化获得 11株 (编号TH1～TH11)能在 6 0℃条件下生长的高温细菌。将所分离菌株接入浓度为 2 0 % (w v)的新鲜奶牛粪水中 ,检测菌株适应性能力。试验结果显示 ,TH9在粪水中生长良好 ,6 0℃培养 36h活菌数达到 6 .4× 10 8CFU ml。经初步鉴定 ,TH9为微杆菌 (Microbacteriumspp .)