分子对接和动力学模拟提高嗜热蛋白酶PhpI的活力

通过分子对接和动力学模拟对嗜热蛋白酶的分子进行改造,确定蛋白酶PH1704(PhpI)定点突变残基,并通过分子生物学实验进行验证.突变体K43C的蛋白酶活力提高了5.8倍.分子动力学模拟结果表明,经过8 ns的动力学模拟后,K43C突变体二级结构由野生型的S2片层(F11-E12-D13)变成环状结构.E12和K43均是活性位点的重要残基,这种变化将导致活性位点的柔性增强,有利于催化反应的发生.

嗜热蛋白酶PH1704别构中心量子化学计算与突变体动力学

通过量子化学计算，确定嗜热菌PyrococcushorikoshiiOT3的PHl704蛋白酶别构位点的关键残基为Argll3，Tyrl20和Asnl29．其中，Argll3及Asnl29与别构抑制剂结合，参与别构调控．Tyrl20残基位于亚基交界面附近，并与亲核残基Cys100之间以氢键相连，可通过影响亚基聚合来影响酶的亲核催化．DJ-1超家族的4种构建蛋白的结构显示，120位点位于亚基交界面处，影响亚基的聚合，进而影响蛋白酶的活力，并间接参与别构调控．分子生物学实验显示，突变体R113T／Y120P／N129D的kcat/km（L·μmol^-1·min^-1）值是野生型kcat/km。值的6倍，h系数由野生型的0．86转变为1．3，负协同效应消失．113和129位点处阴离子别构剂脱离，从而破坏113，120和129位点间的封闭环结构，使AC交界面胡螺旋（124～129，524—529）间聚合度增强；120位点残基由rryr转变为Pro，与Cys100间氢键断裂，亲核进攻的阻力减小，从而使酶活力提高，别构负调控消失．

嗜热蛋白酶生产菌Bacillus sp.DPE_7的产酶条件研究

芽孢杆菌(Bacillussp.)DPE7产嗜热蛋白酶的适宜条件,较好的碳源是0.1%葡萄糖,最佳氮源为酵母粉加硫酸铵,在pH6～11范围内产酶均良好.在65℃,175r/min,pH9的产酶培养基中发酵24h,产酶量可达23.4U/mL.0.01%MnCl2,0.15%CaCl2或0.15%吐温存在时能刺激菌株产酶.

嗜热蛋白酶生产菌的筛选

从温泉水、高温堆肥等样品中初筛到62株嗜热蛋白酶生产菌,进一步复筛出一株高产嗜热蛋白酶的生产菌株DPE7(菌株来自温泉水),该菌株被初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp．)．嗜热蛋白酶生产的最适碳源是葡萄糖, 最佳氮源为酵母粉加硫酸铵,Ca2+对菌株产酶具有促进作用．在65℃、175 r／min、pH 9的产酶培养基中振荡培养 24 h后,发酵液中的酶产量高达23．4 U／mL(60℃测定)．

嗜热蛋白酶的研究与应用

介绍了国内外关于嗜热蛋白酶的研究成果与应用现状.包括产生嗜热蛋白酶的微生物种类,嗜热蛋白酶的特点、稳定机制及基因的克隆策略,嗜热蛋白酶的生产、提取、纯化以及应用.

常温环境中产嗜热蛋白酶菌资源

通过计数、分离与筛选,对常温环境嗜热菌和产嗜热蛋白酶菌的分布及资源状况进行了研究。结果表明,常温环境中存在着一定数量的嗜热菌和产嗜热蛋白酶菌。土壤与水体相比,其嗜热菌资源相对丰富,且耕作肥沃的土壤中产嗜热蛋白酶菌多于贫瘠土壤;在水环境中,无论湖水、江水还是处理中的废水,在常温条件下均有一定比例的嗜热菌和产嗜热蛋白酶菌。在啤酒废水曝气阶段,产嗜热蛋白酶菌占嗜热菌的比例较大,达45%。本研究筛选的1株嗜热菌其产嗜热蛋白酶活性较高,该菌株在pH7·6、温度68℃条件下其蛋白酶活力达到642U·ml-1。该项研究为开发产嗜热蛋白酶菌资源,在工业和环境治理等方面的应用提供重要科学依据。

芽孢杆菌嗜热蛋白酶的性质研究

对芽孢杆菌嗜热蛋白酶的性质进行了研究.该酶的分子量为32kD,最适作用pH为9 0,最适作用温度为85℃,具有良好的pH稳定性(在60℃时,pH稳定范围为6 0～11 0;在80℃时,pH稳定范围为6 0～10 0)和热稳定性(90℃时酶活的半衰期为20min).钙离子和有机溶剂能提高该酶的热稳定性,而EDTA和PMSF则能抑制该酶活性.

印尼热泉中产嗜热碱性蛋白酶菌株筛选及酶学性质研究

采用MSM寡营养培养基从印度尼西亚Pantai cermin,Kalianda和Banyuwedang三个地区的热泉水样、泥样以及沉积物样品中分离获得细菌菌株,通过检测蛋白酶产生透明圈和福林酚蛋白酶活性测定相结合的方法,从中筛选出1株产嗜热蛋白酶的菌株PBI,该菌株经初步鉴定为短杆菌属(Brevibacillus),并对其酶学性质进行了研究。结果表明,菌株PBI产蛋白酶的最适酶活温度为60℃,最适pH值为8.0～9.0,具有较好的热稳定性和pH稳定性,60℃时酶的半衰期为30min,70℃条件下20min仍保持46.1%的酶活,该酶在pH值为5.0～9.0范围的缓冲液中酶活相对稳定。其产嗜热蛋白酶的酶活力最高可达到60.53U/mL,在100℃条件下仍能保留26.37%的相对酶活。Fe2+,Fe3+,Cu2+和Zn2+对嗜热蛋白酶活性具有明显的抑制作用。该嗜热蛋白酶对EDTA敏感,苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑酶肽(Leupeptin)、苄眯(Benzamidine)和胃蛋白酶抑制剂(Pepstain A)对该嗜热蛋白酶都有一定的抑制作用,说明其酶活性受到丝氨酸、半胱氨酸残基的影响。结果表明,该菌株是1株具有进一步改造利用价值的产蛋白酶菌株。

嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3蛋白酶基因的原核表达、纯化和性质表征

将来源于嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的蛋白酶(PH1704)基因在大肠杆菌BLP-CodonPlus中高效表达.采用超声、热失活和HiTrap Q Sepharose柱层析等方法对产物进行分离纯化.通过SDS-PAGE,Native-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,发现该重组酶以十二聚体为主的寡聚体形式存在,并具有SDS抗性.蛋白酶活力染色表明,其六聚体以上有活力.以azo-gelation为底物,对其酶学性质进行初步研究表明,其最适温度为85℃,最适pH=8.0,并且具有良好的热稳定性.

镧(Ⅲ)对工程菌产嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶活力的影响

讨论了镧对重组枯草杆菌 (DB10 4 /PPR8)产嗜热脂肪芽孢杆菌蛋白酶活力的影响 ,对其活性按测定碱性蛋白酶活性的一般方法进行了测定 ,实验结果表明 :1.0× 10 -5、1.0× 10 -6、1.0×10 -7mol· L-1L a( )作用显著 ;1.0× 10 -4 mol· L-1L a( )对酶活力影响下明显 ;1.0× 10 -3 mol· L-1L a( )降低了蛋白酶活力 ,但在此浓度下 ,L a( )对该酶不构成致命性威胁 .