嗜热踝节菌脂肪酶(TTL)的重组表达及催化合成普瑞巴林手性中间体

以催化合成普瑞巴林中间体（3 S）-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸为目标,通过基因挖掘得到来源为嗜热踝节菌的脂肪酶氨基酸序列,构建了基因工程菌Escherichia coli BL21/p ET28b-TTL,在16℃成功诱导表达了嗜热踝节菌脂肪酶TTL。分离纯化得到TTL电泳纯酶,其最适反应温度为50℃,在50℃的半衰期为14.5 d,表明TTL具有良好的热稳定性;TTL最适p H为8.0,在p H 7.0-8.5时稳定性好。TTL在50℃、p H 8.0条件下,催化100 mmol/L外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解转化率达42%以上,产物的对映体过量值（e.e.值）〉94%。这表明TTL在化学-酶法合成普瑞巴林中具有较大应用潜力。

利用质谱分析法从酶谱鉴定嗜热真菌木聚糖酶

通过对前期筛选到的一株嗜热真菌Talaromyces thermophilus WYN9进行产木聚糖酶的诱导和非诱导培养。诱导培养的上清液中可以检测到木聚糖酶酶活。在非变性胶和变性胶SDS-PAGE中,诱导和非诱导的酶谱条带差异明显。以非诱导酶谱为对照,将诱导酶谱中与其有显著差异的条带切下,回收蛋白,测定酶活。将有木聚糖酶酶活的蛋白通过SDS-PAGE进一步分离纯化,切胶后使用胶内酶切法进行预处理,使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)进行分析。结果表明该蛋白与拟青霉属Paecilomyces sp.J18的内切木聚糖酶高度同源。根据质谱分析结果设计兼并引物,通过交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)扩增,获得了TtXynA基因全长。根据Kimura双参数模型用临近相邻法构建了TtXynA及其同源蛋白的进化树。

高产耐热木聚糖酶嗜热真菌F1208的筛选与鉴定

自土样中筛选得到1株高产木聚糖酶霉菌F1208,经菌落培养特征鉴定、菌体形态观察以及18S rDNA序列同源性比对等分析,鉴定该菌株为嗜热踝节菌,命名为嗜热踝节菌F1208。实验结果显示:该菌株最适生长温度50℃。可利用玉米芯等农业废弃物为发酵碳源,生产耐热木聚糖酶。在50℃培养7 d,木聚糖酶酶活力可达1 002.86 U/mL。

嗜热真菌Talaromyces thermophilus F1208产木聚糖酶条件优化

对木聚糖酶嗜热真菌嗜热踝节菌F1208的产酶条件进行优化，经单因素试验及Box—Behnken响应面分析，确定该菌液体发酵培养基，其组成是：碳源为玉米芯粉，碳源粒度24—40目，碳源质量分数5％；氮源为大豆蛋白胨与酵母膏复合氮源（质量比l：3），氮源质量分数2％；辅助添加物甘油（0．2％）；培养基初始pH6．4。优化后最佳产酶条件是：装液量60mL，培养温度48℃，摇床转速200r／min。在此条件下发酵培养7d，产酶量迭3026．65U，mL，是初始酶活（960．39U／mL）的3．15倍，为同类研究中较高水平，具有较好的应用前景。

一株产木聚糖酶嗜热真菌的分子鉴定及酶学性质研究

从深圳市南山区热电厂热废气排放口分离了12株真菌，经产酶发酵复筛，获得了一株具有较高木聚糖酶酶活的嗜热真菌。根据分子鉴定结果，确定该菌株为篮状菌属的嗜热踝节茵（Talaromyces thermophilus）。经玉米芯粉诱导后该菌株的木聚糖酶酶活可达238．13IU/mL。对其粗酶液酶学性质的研究结果表明，该菌株木聚糖酶的最适温度为80℃，于50℃放置30min后酶活可保持原始酶活的92％，具有很好的耐热性和热稳定性；该酶的最适pH为7，且在较宽的pH范围内（pH3-11）具有优异的pH稳定性。上述性质使其在多种工业过程中具有潜在应用价值。