来源于嗜碱芽孢杆菌N16-5甘露聚糖利用基因簇的乙酰酯酶AesA的克隆及性质分析

天然来源的多糖底物上常存在乙酰基取代,特异性的乙酰酯酶能够切割这些底物上的乙酰基,从而有利于聚糖底物的进一步降解。对Bacillus sp.N16-5甘露聚糖利用基因簇上编码的乙酰酯酶AesA进行了基因克隆和异源表达,并对其酶学性质进行了研究。aesA基因长957bp,编码318个氨基酸,属于碳水化合物酯酶第7家族。AesA对4-甲基伞形酮乙酸酯(4-methylumbelliferyl-acetate)表现出较好的催化活性,金属离子Fe^3+、Fe^2+、Mn^2+及Cu^2+对AesA活性均有不同程度的促进作用。AesA与甘露聚糖酶ManA对乙酰化的甘露聚糖底物具有显著的协同作用。此项研究有助于理解嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5对甘露聚糖的水解机制,并且在甘露聚糖降解中具有潜在的应用前景。

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. N16-5表达载体的构建

【目的】构建可以在嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5中表达外源基因的表达载体。【方法】以枯草芽孢杆菌表达质粒pHCMC04为基本骨架,删除木糖诱导的启动子和木糖阻遏蛋白基因,分别插入枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43和嗜碱芽孢杆菌N16-5的组成型启动子P EF,构建表达载体pABN165P43和pABN165P EF;将绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因连接至表达载体得到pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp,利用原生质体转化法将其转化至Bacillus sp.N16-5,通过荧光显微镜和多功能荧光读板仪检测报告基因的表达情况。【结果】所构建的表达载体pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp可以在Bacillus sp.N16-5中表达报告基因gfp,荧光定量数据显示,在7.5 h左右开始检测到绿色荧光蛋白的表达,从7.5 h到12 h荧光强度随时间增长迅速并在12 h左右达到最大,最大荧光值在7000左右。【结论】成功构建了2个嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5表达载体,实现了外源基因在嗜碱芽孢杆菌中的表达。

嗜碱Bacillus sp.N16-5不同碳源条件下比较蛋白质组分析

为了解碳水化合物对嗜碱微生物代谢途径的影响,用蛋白质组学方法比较分析了不同碳源条件下培养的嗜碱菌的胞浆蛋白质变化,试图找到差异表达的蛋白.分离自内蒙古乌杜淖尔碱湖的嗜碱Bacillussp.N16-5,在含有5种不同碳源(葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖)的培养基中培养.比较蛋白质组学分析鉴定了61个差异表达蛋白,它们主要参与碳水化合物代谢、氨基酸转运和代谢、能量的产生和贮存.结果表明,不同碳水化合物条件下参与中央代谢途径酶的丰度发生了很大的变化,尤其是碳代谢调控蛋白A(CcpA)均被上调.同时发现,在CcpA参与调控的碳代谢抑制现象中戊糖表现出比己糖更强的效应.上述结果为进一步理解嗜碱微生物碳水化合物代谢奠定了基础.