嗜线虫致病杆菌北京变种质粒形态的研究

嗜线虫致病杆菌是小卷蛾斯氏线虫体内的共生细菌,在实验室条件下延长培养将会出现型态变异,即从野生型的Ⅰ型细胞变为Ⅱ型细胞。本文以嗜线虫致病杆菌北京变种Ⅰ、Ⅱ型菌株为材料,对其质粒形态进行了研究。运用碱裂解法提取质粒,电泳结果发现Ⅰ型菌带型单一,只有一条,分子量大于23kb,命名为pBJ-1。而Ⅱ型菌株除了含有大于23kb的条带外,还有另一条带出现在6kb的位置上,分别命名为pBJ-2和pBJ-3。限制性内切酶处理后,两菌株质粒得到的消化产物有所不同,即嗜线虫致病杆菌北京变种Ⅰ型、Ⅱ型菌株之间的质粒存在差异。本试验还尝试将质粒pBJ-1和pBJ-2分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,并证明这两种质粒上可能含有氨苄青霉素抗性基因和链霉素抗性基因。

嗜线虫致病杆菌北京变种的抗生素抗性及质粒pLA2917的转化

用最小抑制浓度法对嗜线虫致病杆菌北京变种野生型菌株的抗生素抗性进行了测定。结果表明,该菌株对氯霉素、新霉素和卡那霉素敏感,而对链霉素、氨苄青霉素和青霉素具有不同程度的抗性。利用滤膜三亲交配的接合转移方法,以嗜线虫致病杆菌北京变种作为受体细菌,在卡那霉素、四环素和氨苄青霉素的选择压力下,筛选得到接合转移子。经过菌落PCR鉴定,证明质粒pLA2917已经成功转移到嗜线虫致病杆菌北京变种细胞内。对昆虫病原线虫共生细菌的质粒转移方法进行了讨论。

嗜线虫致病杆菌北京变种的型变进程及抗生素相关性质的研究

嗜线虫致病杆菌是小卷蛾斯氏线虫体内的共生细菌,在实验室条件下延长培养将会出现型态变异,即从野生型的I型细胞变为II型细胞。对嗜线虫致病杆菌北京变种的型变进程进行了研究,结果发现,嗜线虫致病杆菌北京变种I型菌株在LB培养基中培养4 d即有II型菌出现;培养10 d后,II型菌的比例超过50%;培养到22 d时,II型菌在整个NBTA平板中的比例几乎达到95%。然后分别以I型菌株和II型菌株为材料,对其产素能力和抗生素抗性水平进行了比较,结果显示,北京变种II型菌株对枯草芽孢杆菌的抑制水平降低到I型菌的10.08%;2种型态的菌株均对青霉素和氨苄青霉素具有抗性,其中I型菌株的耐受程度高于II型菌株,因此,嗜线虫致病杆菌北京变种2型细胞的产抗生素能力差异与抗生素抗性水平差异之间可能存在相关性。

嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株杀虫蛋白对棉铃虫幼虫的生物活性

嗜线虫致病杆菌北京变种 Xenorhabdus var.pekingensis CB6菌株是本研究室自主分离的新菌株,其代谢物对棉铃虫具有很强的拒食和抑制生长活性。为了进一步明确代谢物中杀虫蛋白的生物活性,作者用饲料染毒法和叶碟法测定了杀虫蛋白对棉铃虫不同龄期幼虫取食和生长发育的影响。结果表明,杀虫蛋白对棉铃虫幼虫有很强的抑制生长作用,用64μg/g 含杀虫蛋白饲料饲喂初孵、1、2和3龄幼虫5天的生长抑制率分别达95.37%、92.73%、87.15%和88.64%,并明显延长幼虫发育历期,影响幼虫的化蛹及蛹的羽化。杀虫蛋白对5龄棉铃虫幼虫拒食效果明显,幼虫饲喂经1.6mg/mL 杀虫蛋白处理的叶片24h,选择性拒食率和非选择性拒食率分别为76.22%和85.42%。当蛋白浓度为0.32mg/mL 时,24h 选择性拒食和非选择性拒食率分别为68.39%和74.75%。

高毒力杀虫细菌嗜线虫致病杆菌CB6菌株的培养基优化

用正交试验法研究了嗜线虫致病杆菌北京变种菌株CB6的营养利用以及培养基成分的改变对产生杀虫活性物质的影响。通过筛选该菌对碳源、氮源以及无机盐的需求,确定了该菌的最佳发酵培养基为(g/L):豆粉40g,蔗糖15g,蛋白胨15g,酵母膏10g,玉米浆5g,NaH2PO41g,NaCl5g,谷氨酸5g。培养液上清液对玉米螟初孵幼虫的体重抑制率为90 81%,比基础培养基的杀虫活性提高了46.5%。

嗜线虫致病杆菌HB310菌株杀虫蛋白的纯化及活性鉴定

嗜线虫致病杆菌XenorhabdusnematophilaHB310是从河北省土壤中筛选出的一株昆虫病原线虫体内分离纯化获得的共生菌,该菌的发酵液对多种昆虫有较高的杀虫活性。利用85%饱和度的硫酸铵盐析分别获得胞内蛋白提取物和上清液中胞外蛋白提取物,生测结果表明这两种蛋白提取物中都含有胃毒素和血腔毒素。通过制备型非变性凝胶电泳对蛋白提取物进行分离和纯化,得到了3种有杀虫活性的毒素蛋白(毒素Ⅰ、毒素Ⅱ和毒素Ⅲ),胞内的毒素蛋白与分泌到胞外上清液中的毒素蛋白是同种蛋白。毒素Ⅰ和毒素Ⅱ对棉铃虫初孵幼虫有明显的胃毒活性,但没有血腔毒性;毒素Ⅲ对大蜡螟幼虫有很强的血腔毒性,LD50为0.18μg头。SDS_PAGE图谱显示毒素Ⅰ和毒素Ⅱ是由多个多肽组成的复合蛋白,而毒素Ⅲ只分离出一条多肽。毒素Ⅱ在50℃处理10min,其杀虫活性没有显著变化;70℃处理10min对毒素Ⅲ杀虫活性没有显著影响。

嗜线虫致病杆菌杀虫毒素对棉铃虫的中肠组织病理学研究

嗜线虫致病杆菌HB310菌株与小卷蛾斯氏线虫HB310共生,对多种昆虫均具有较高生物活性。本实验通过盐析和非变性凝胶电泳等方法从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化出具胃毒活性的蛋白毒素Ⅱ。经毒素Ⅱ处理的棉铃虫幼虫,中肠组织的病理学变化类似于发光杆菌Tca毒素和Btδ-内毒素。棉铃虫4龄幼虫口服毒素Ⅱ6h后中肠组织开始发生变化:首先围食膜前端破碎,中肠柱状细胞伸长;随着时间推移,12h后整个围食膜被破坏消失,中肠组织病变加重,肠壁细胞排列疏松混乱;随着毒素作用的逐渐减弱,处理72h后棉铃虫中肠围食膜又重新出现。毒素Ⅱ离体处理棉铃虫围食膜,同样可以导致围食膜破碎。

嗜线虫致病杆菌血腔毒素Tp40对大蜡螟幼虫体内酶活性和中肠组织的影响

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila在侵入到寄主昆虫血腔后能够成功地逃避或抑制寄主昆虫的免疫反应并快速杀死昆虫。为深入了解嗜线虫致病杆菌的杀虫机理,明确关键的致病因子,作者应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法,从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化了一种新的杀虫蛋白——Tp40,该蛋白对大蜡螟Galleria mellonella具有高血腔注射活性,对大蜡螟5龄幼虫的LD50为68.54ng/头。本文检测了该毒素对大蜡螟幼虫的致病特性,注射Tp40毒素后,大蜡螟幼虫表现出兴奋和痉挛等症状,当以不低于(70±0.02)ng/头的剂量注射Tp40,大蜡螟幼虫均在20min内死亡,但试虫的体色、血淋巴的颜色以及血细胞的形态没有发生明显的变化。对大蜡螟体内酶活性的测定结果显示,在注射LD50剂量的Tp40蛋白后,试虫体内羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活力都明显的高于对照(P<0.05),而酚氧化酶活力显著低于对照(P<0.05)。对大蜡螟幼虫中肠的组织病理学研究显示:这种42kDa蛋白能够破坏试虫的中肠组织,导致其肠壁细胞出现排列紊乱、脱落和围食膜消失。据此推测,Tp40与嗜线虫致病杆菌对寄主昆虫的免疫抑制有关,寄主中肠组织可能是其作用靶标之一。

嗜线虫致病杆菌代谢物拮抗大豆疫霉

测定嗜线虫致病杆菌 (Xenorhabdusnematophilus)发酵液对大豆疫霉 (Phytophthorasojae )菌丝生长、孢子囊形成及萌发的影响 ,采用种子和土壤处理的方法研究了发酵液对幼苗发病率的作用。结果表明 :发酵液对大豆疫霉 (Phytophthorasojae)菌丝生长有较强的抑制作用 ,5 0ml/L发酵液能完全抑制菌丝的生长 ,6ml/L发酵液的抑制率仍达 6 8.86 % ;发酵液能强烈抑制大豆疫霉的孢子囊形成 ,10ml/L - 10 0ml/L的发酵液处理孢子囊 8天后的抑制率分别达 97.0 4 %和 99.19% ,5ml/L发酵液仍达到 82 .74 %的抑制率 ;发酵液对孢子囊的萌发有一定抑制作用 ,处理后 4 8小时 ,6ml/L - 10 0ml/L发酵液的抑制率达 72 .94 % - 88.5 6 % ;发酵液浸种结果表明 ,发酵液浓度为2 5ml/L - 5 0ml/L对大豆种子萌发均没有显著影响。用浓度为 5 0ml/L的发酵液处理种子 ,播种后9天 ,病株减退率可达 79.8% ,但 12天调查 ,病株减退率仅达 34.4 %。发酵液处理带菌土壤能有效减轻大豆幼苗的发病率 ,5 0ml/L发酵液处理的病株减退率为 76 .3% ,化学农药甲霜灵处理的病株减退率为 84 .0 %。

嗜线虫致病杆菌代谢产物CB6-1的分离、纯化与结构鉴定

目的从对植物疫病有拮抗作用的嗜线虫致病杆菌北京变种(X enorhabdus nem a toph ilus var.p ek ing ensis)CB 6菌株的发酵产物中分离纯化抗菌组分,并鉴定其结构。方法采用多种层析方法对其进行分离,并采用UV、IR、M S和NM R对其进行结构鉴定。结果分离到一个主要组分CB 6-1,并鉴定其结构为3,4-二氢-8-羟基苯并吡喃衍生物。结论主要抗菌组分CB 6-1与文献报道的X encoum ac in 1相同。

嗜线虫致病杆菌血腔毒素Tp40的纯化和特性分析

【目的】嗜线虫致病杆菌是一种昆虫病原线虫共生菌,它能够产生多种杀虫毒素。本研究旨在从嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310菌株的细胞内纯化新的杀虫蛋白毒素,并对其进行基因克隆和序列分析。【方法】应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法纯化蛋白,再通过对5龄大蜡螟幼虫血腔注射进行活性筛选。对获得的目的蛋白与已知蛋白进行同源分析,克隆出该目的蛋白的基因序列,从而进行相应的基因和氨基酸序列分析。【结果】本研究纯化的Tp40蛋白对大蜡螟LD50为68.54ng/头,其SDS-PAGE电泳图谱只显示出一条分子量约为42kDa的多肽。Western印迹分析表明Tp40与已知的Txp40为同源蛋白,并且仅存在于细胞内。编码该蛋白的基因开放读码框全长1107bp(GenBank登录号:EU095326),编码368个氨基酸残基,预测分子量为41.5kDa,等电点为8.66,与GenBank中的其余13株昆虫病原线虫共生菌所包含的相似基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为85%～99%和70%～99%。【结论】Tp40蛋白具有很高的血腔杀虫活性,其基因序列具有较强的保守性,是昆虫病原线虫共生菌复合体杀虫过程中的一种关键因子。

嗜线虫致病杆菌代谢物对马铃薯晚疫病菌的抑制作用

采用室内平板抑制法测定的结果表明 :嗜线虫致病杆菌发酵液对马铃薯晚疫病菌有很强的抑制生长作用 ,6～ 5 0 ml/ L的发酵液对菌丝生长的抑制率达 90 %～ 1 0 0 % ,1 .5～ 3ml/ L的发酵液仍有 70 %左右的抑制效果。发酵液对菌丝生长有抑制作用 ,但不能完全杀死菌丝 ;发酵液对孢子囊萌发也有一定的抑制作用 ,5 0 ml/ L的发酵液对孢子囊萌发的抑制率达 5 0 % ;发酵液在 2 4小时内能渗透到种薯内 3cm,抑制薯块内病菌的生长。因此 ,代谢物将有可能用于种薯处理 ,延缓或控制病害的流行。

嗜线虫致病杆菌CB6菌株对小菜蛾幼虫生物活性的研究

用叶碟法测定了嗜线虫致病杆菌CB6菌株发酵液对小菜蛾幼虫的致死率、拒食活性以及对生长发育的影响。结果表明 ,其发酵液对幼虫有较高的生物活性 ,取食 3d后 ,1～ 3龄幼虫的校正死亡率分别为 84 75 %、6 8 33%和 5 9 32 %。 4龄幼虫取食量显著减少 ,选择性拒食率为 76 5 9% ,非选择性拒食率为 6 9 72 %。 3龄幼虫取食发酵液处理的叶片后 ,生长极其缓慢 ,在 4 8h时体重抑制率达 10 0 % ,化蛹率和羽化率均明显下降 ,其中化蛹率仅为 15 5 6 % ,10 0 %蛹不能羽化。

嗜线虫致病杆菌CB6菌株胞内外杀虫蛋白的纯化及比较研究

【目的】分离和纯化嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophila var.pekingensis)CB6菌株胞内和胞外杀虫蛋白,鉴定其蛋白种类。为进一步利用此类杀虫蛋白奠定基础。【方法】采用硫酸铵沉淀、DEAESepharoseFF离子交换柱层析、Butyl SepharoseFF疏水柱层析和SephacrylS-200HR凝胶过滤对该类蛋白进行分离和纯化,采用Native-PAGE和SDS-PAGE技术对所纯化蛋白进行组分分析。【结果】获得达电泳纯的胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2。以2.58μg·ml-1含量E1、以4.21μg·ml-1含量E2喂饲棉铃虫初孵幼虫,对幼虫的生长抑制率分别达62.63%和97.9%。E1、E2经相同纯化参数处理获得的洗脱图相似,经native-PAGE和SDS-PAGE呈现出相似的单带电泳图谱。SDS-PAGE测得E1、E2表观分子量大于212kD,该杀虫蛋白在60℃仍表现出较强的活性。电泳染色结果表明该类蛋白非糖蛋白也非酯蛋白。【结论】CB6菌株胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2可能是同一种(类)蛋白。

嗜线虫致病杆菌产生抗生素的培养基及条件

本文对嗜线虫致病杆菌 (Xenorhabdus nematophilus)产生抗生素的发酵培养基和发酵条件进行了研究 ,同时对该菌代谢过程 p H值、还原糖、总糖、氨基氮与抗生素产量的关系进行了分析。通过筛选该菌对碳源和氮源的要求 ,用正交试验初步确定了该菌产素的最佳发酵培养基和条件为 :玉米粉 1% ,大豆粉 3% ,蔗糖 1% ,蛋白胨 1.5% ,KH2 PO4 0 .0 2 % ,Mg SO4 0 .2 % ,活化剂 T0 .1% ;发酵培养基的起始 p H值在 6 .0～ 8.0 ,种龄 16 h,接种量 4 % ,50 0 m L摇瓶装量 15～ 150 m L的条件下培养 72 h可获得较高的抗生素产量 ;产素量与菌代谢过程中 p H、还原糖、总糖和氨基氮的变化有一定关系 ,通过培养基和培养条件的研究使该菌的产抗生素能力提高了 56 .3%。

嗜线虫致病杆菌的抑菌物质及抑菌活性

嗜线虫致病杆菌北京变种（Xenorhabdus nematophila var．pekingense）是从北京地区采集的小卷蛾斯氏线虫（Steinernema carpocapsae）肠道内分离的共生细菌，具有自主知识产权，分离纯化出其发酵代谢物中的抗菌物质，进行抗菌活性测定，对研究该菌的抑菌机理以及开发利用具有重要意义。本文从该菌株代谢物中分离获得的抗菌物质经紫外光谱、红外光谱、核磁共振、高分辨质谱以及理化性质分析，鉴定为Xenocoumacin 1。用平板含毒培养基法测定了该物质对12种植物病原真菌的抑菌活性。研究表明，分离的活性物质具有较强的抑制活性，浓度在10μg／mL时，对黄瓜疫霉病菌、苎麻疫霉病菌、辣椒疫霉病菌，西葫芦灰霉病菌，苹果斑点落叶病菌的菌丝抑制率为100％。对草莓疫病病菌、苹果腐烂病菌、苹果褐斑病菌、着茄灰霉病菌、苹果轮纹病菌抑制率分别为86.8％、79．4％、79．5％、62．6％、53．6％；对其中6种真菌的EC50为0．25-4．17 μg／mL，该物质对疫霉属真菌抑制作用最强，并能引起番茄晚疫病菌的菌丝生长畸形，原生质外溢。本文对开发新型生物杀菌剂的研究奠定了基础。

嗜线虫致病杆菌HB310菌株对东亚飞蝗的生物活性

通过生物测定比较了9种昆虫病原线虫共生菌对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis4龄蝗蝻的杀虫活性,其中嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310菌株(以下简称Xn HB310)对4龄蝗蝻的活性最高;采用浸叶法进一步测定了Xn HB310菌液对不同虫态的东亚飞蝗的毒力。结果表明:在饲喂96 h后,Xn HB310菌液对2龄蝗蝻、4龄蝗蝻和成虫的致死中浓度(LC50)分别为2.97×105、4.90×105和6.24×105CFU/mL,致死中时间(LT50)分别为51.48、52.59和64.34 h。研究还发现该菌株对东亚飞蝗具有明显的拒食活性,处理48 h后Xn HB310菌液对2龄蝗蝻、4龄蝗蝻和成虫的拒食中浓度(AFC50)分别为1.15×105、2.36×105和3.16×105CFU/mL。通过点滴或剪除东亚飞蝗成虫感觉器官的方法,证实了Xn HB310菌液对东亚飞蝗产生拒食作用的器官是下颚须和下唇须,剪除下颚须和下唇须及两者均剪除的拒食率分别为37.36%、51.28%和100%。研究结果表明,嗜线虫致病杆菌Xn HB310菌液对东亚飞蝗的杀虫速度快且活性高,具有开发为防治东亚飞蝗杀虫剂的潜力。

嗜线虫致病杆菌HB310培养基筛选和培养条件优化

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila是与小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae互惠共生的一种革兰氏阴性菌,对多种农业害虫都具有很高的杀虫活性。本研究对多种影响嗜线虫致病杆菌HB310菌株发酵培养的因素进行了筛选优化。通过单因素试验确定最佳碳源、氮源和无机盐分别为葡萄糖、牛肉蛋白胨和KH2PO4;通过正交实验确定培养基的最优组合为:葡萄糖2%、牛肉蛋白胨1%、牛肉浸膏0.3%和K2HPO41%;最佳摇瓶培养条件为:接种量6%、培养基p H 7.5、摇床转速200 rpm、培养温度28℃和培养时间48 h,在此条件下,嗜线虫致病杆菌HB310菌株生长速率最快,菌液的杀虫活性最高。