胰岛素对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫0657L生长发育及其共生细菌伯氏致病杆菌0657L的影响

【目的】为探讨胰岛素对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫Steinernema kraussei 0657L生长发育及其共生细菌的影响。【方法】吸取1.5 mL 3000头/mL的卡森斯氏线虫0657L悬浮液侵染大蜡螟Galleria mellonella 3龄幼虫,25℃培养24 h后分离卡森斯氏线虫0657L的共生细菌伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovenii 0657L;分别用1∶500胰岛素和1∶5000胰岛素处理伯氏致病杆菌0657L后饲喂卡森斯氏线虫0657L,借助体视显微镜观测伯氏致病杆菌0657L在胰岛素处理1~6 d时的菌落直径并计算生长速率,计算卡森斯氏线虫0657L寿命、存活率、每30 s头部摆动次数和每30 s吞咽次数,评价其平均寿命、运动能力及吞咽能力。【结果】与空白对照组相比,1∶5000胰岛素和1∶500胰岛素处理组伯氏致病杆菌0657L的菌落直径在对数生长期(处理2 d时)可分别增大77.2%和54.0%,生长速率可由空白对照组的68.0μm/d分别提高至120.4和104.7μm/d;卡森斯氏线虫0657L寿命分别延长27.3%和45.5%;卡森斯氏线虫0657L 3龄幼虫每30 s头部摆动次数分别提高56.3%和74.7%,3和4龄幼虫及成虫每30 s吞咽次数分别提高50.9%和65.5%,26.8%和35.2%及23.7%和21.1%。【结论】胰岛素可以显著促进卡森斯氏线虫0657L共生细菌伯氏致病杆菌0657L单菌落的生长和提高其生长速率,能够通过伯氏致病杆菌0657L间接延长卡森斯氏线虫0657L的寿命,提高昆虫病原线虫的运动和吞咽能力。本研究结果可以为延长昆虫病原线虫商品货架期提供科学依据,为昆虫病原线虫的高效生物防治提供理论基础。

嗜线虫致病杆菌HB310菌株杀虫蛋白的纯化及活性鉴定

嗜线虫致病杆菌XenorhabdusnematophilaHB310是从河北省土壤中筛选出的一株昆虫病原线虫体内分离纯化获得的共生菌,该菌的发酵液对多种昆虫有较高的杀虫活性。利用85%饱和度的硫酸铵盐析分别获得胞内蛋白提取物和上清液中胞外蛋白提取物,生测结果表明这两种蛋白提取物中都含有胃毒素和血腔毒素。通过制备型非变性凝胶电泳对蛋白提取物进行分离和纯化,得到了3种有杀虫活性的毒素蛋白(毒素Ⅰ、毒素Ⅱ和毒素Ⅲ),胞内的毒素蛋白与分泌到胞外上清液中的毒素蛋白是同种蛋白。毒素Ⅰ和毒素Ⅱ对棉铃虫初孵幼虫有明显的胃毒活性,但没有血腔毒性;毒素Ⅲ对大蜡螟幼虫有很强的血腔毒性,LD50为0.18μg头。SDS_PAGE图谱显示毒素Ⅰ和毒素Ⅱ是由多个多肽组成的复合蛋白,而毒素Ⅲ只分离出一条多肽。毒素Ⅱ在50℃处理10min,其杀虫活性没有显著变化;70℃处理10min对毒素Ⅲ杀虫活性没有显著影响。

嗜线虫肠杆菌抑制大蜡螟幼虫的免疫反应

为探究嗜线虫肠杆菌对大蜡螟幼虫的致病机理,测定被嗜线虫肠杆菌侵入的大蜡螟幼虫的血淋巴中酶(酚氧化酶(PO)和羧酸酯酶(CarE))活性和能源(蛋白质、总糖)含量及其肠道内Imd信号通路中PGRP-LB基因表达量的变化。结果表明:嗜线虫肠杆菌侵入大蜡螟幼虫后,在0~84 h期间,PO和CarE活性表现出“升高—峰值—下降”的变化,血淋巴蛋白质含量持续升高且显著高于对照,总糖含量快速降低且显著低于对照;在0~60 h期间,Imd信号通路中负调控因子PGRP-LB基因表达量呈现急速上升(18 h时表达量最高)又急速下降趋势,而且在适当时间停喂嗜线虫肠杆菌,其肠道内PGRP-LB基因的含量能恢复正常,显示Imd信号通路的免疫调节作用。嗜线虫肠杆菌的侵入对大蜡螟幼虫血腔代谢和肠道免疫系统产生影响,说明它在抑制寄主昆虫免疫反应中发挥重要作用。

昆虫病原线虫共生细菌嗜线虫杆菌和发光杆菌的型变

嗜线虫杆菌 (Xenorhabdusspp .)和发光杆菌 (Photorhabdusspp .)是与昆虫病原线虫互惠共生的细菌 ,Xenorhabdus和Pho torhabdus的一个显著特点是在共生菌体外培养期间出现细胞的型变 ,其型变的发生在几个方面不同于传统的型变。本文就近年来有关共生菌型变的生物学、遗传学等方面的研究进行了概述。

嗜线虫致病杆菌杀虫毒素对棉铃虫的中肠组织病理学研究

嗜线虫致病杆菌HB310菌株与小卷蛾斯氏线虫HB310共生,对多种昆虫均具有较高生物活性。本实验通过盐析和非变性凝胶电泳等方法从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化出具胃毒活性的蛋白毒素Ⅱ。经毒素Ⅱ处理的棉铃虫幼虫,中肠组织的病理学变化类似于发光杆菌Tca毒素和Btδ-内毒素。棉铃虫4龄幼虫口服毒素Ⅱ6h后中肠组织开始发生变化:首先围食膜前端破碎,中肠柱状细胞伸长;随着时间推移,12h后整个围食膜被破坏消失,中肠组织病变加重,肠壁细胞排列疏松混乱;随着毒素作用的逐渐减弱,处理72h后棉铃虫中肠围食膜又重新出现。毒素Ⅱ离体处理棉铃虫围食膜,同样可以导致围食膜破碎。

嗜线虫致病杆菌血腔毒素Tp40对大蜡螟幼虫体内酶活性和中肠组织的影响

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila在侵入到寄主昆虫血腔后能够成功地逃避或抑制寄主昆虫的免疫反应并快速杀死昆虫。为深入了解嗜线虫致病杆菌的杀虫机理,明确关键的致病因子,作者应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法,从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化了一种新的杀虫蛋白——Tp40,该蛋白对大蜡螟Galleria mellonella具有高血腔注射活性,对大蜡螟5龄幼虫的LD50为68.54ng/头。本文检测了该毒素对大蜡螟幼虫的致病特性,注射Tp40毒素后,大蜡螟幼虫表现出兴奋和痉挛等症状,当以不低于(70±0.02)ng/头的剂量注射Tp40,大蜡螟幼虫均在20min内死亡,但试虫的体色、血淋巴的颜色以及血细胞的形态没有发生明显的变化。对大蜡螟体内酶活性的测定结果显示,在注射LD50剂量的Tp40蛋白后,试虫体内羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活力都明显的高于对照(P<0.05),而酚氧化酶活力显著低于对照(P<0.05)。对大蜡螟幼虫中肠的组织病理学研究显示:这种42kDa蛋白能够破坏试虫的中肠组织,导致其肠壁细胞出现排列紊乱、脱落和围食膜消失。据此推测,Tp40与嗜线虫致病杆菌对寄主昆虫的免疫抑制有关,寄主中肠组织可能是其作用靶标之一。

嗜线虫致病杆菌代谢物拮抗大豆疫霉

测定嗜线虫致病杆菌 (Xenorhabdusnematophilus)发酵液对大豆疫霉 (Phytophthorasojae )菌丝生长、孢子囊形成及萌发的影响 ,采用种子和土壤处理的方法研究了发酵液对幼苗发病率的作用。结果表明 :发酵液对大豆疫霉 (Phytophthorasojae)菌丝生长有较强的抑制作用 ,5 0ml/L发酵液能完全抑制菌丝的生长 ,6ml/L发酵液的抑制率仍达 6 8.86 % ;发酵液能强烈抑制大豆疫霉的孢子囊形成 ,10ml/L - 10 0ml/L的发酵液处理孢子囊 8天后的抑制率分别达 97.0 4 %和 99.19% ,5ml/L发酵液仍达到 82 .74 %的抑制率 ;发酵液对孢子囊的萌发有一定抑制作用 ,处理后 4 8小时 ,6ml/L - 10 0ml/L发酵液的抑制率达 72 .94 % - 88.5 6 % ;发酵液浸种结果表明 ,发酵液浓度为2 5ml/L - 5 0ml/L对大豆种子萌发均没有显著影响。用浓度为 5 0ml/L的发酵液处理种子 ,播种后9天 ,病株减退率可达 79.8% ,但 12天调查 ,病株减退率仅达 34.4 %。发酵液处理带菌土壤能有效减轻大豆幼苗的发病率 ,5 0ml/L发酵液处理的病株减退率为 76 .3% ,化学农药甲霜灵处理的病株减退率为 84 .0 %。

嗜线虫致病杆菌代谢产物CB6-1的分离、纯化与结构鉴定

目的从对植物疫病有拮抗作用的嗜线虫致病杆菌北京变种(X enorhabdus nem a toph ilus var.p ek ing ensis)CB 6菌株的发酵产物中分离纯化抗菌组分,并鉴定其结构。方法采用多种层析方法对其进行分离,并采用UV、IR、M S和NM R对其进行结构鉴定。结果分离到一个主要组分CB 6-1,并鉴定其结构为3,4-二氢-8-羟基苯并吡喃衍生物。结论主要抗菌组分CB 6-1与文献报道的X encoum ac in 1相同。

嗜线虫致病杆菌血腔毒素Tp40的纯化和特性分析

【目的】嗜线虫致病杆菌是一种昆虫病原线虫共生菌,它能够产生多种杀虫毒素。本研究旨在从嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310菌株的细胞内纯化新的杀虫蛋白毒素,并对其进行基因克隆和序列分析。【方法】应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法纯化蛋白,再通过对5龄大蜡螟幼虫血腔注射进行活性筛选。对获得的目的蛋白与已知蛋白进行同源分析,克隆出该目的蛋白的基因序列,从而进行相应的基因和氨基酸序列分析。【结果】本研究纯化的Tp40蛋白对大蜡螟LD50为68.54ng/头,其SDS-PAGE电泳图谱只显示出一条分子量约为42kDa的多肽。Western印迹分析表明Tp40与已知的Txp40为同源蛋白,并且仅存在于细胞内。编码该蛋白的基因开放读码框全长1107bp(GenBank登录号:EU095326),编码368个氨基酸残基,预测分子量为41.5kDa,等电点为8.66,与GenBank中的其余13株昆虫病原线虫共生菌所包含的相似基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为85%～99%和70%～99%。【结论】Tp40蛋白具有很高的血腔杀虫活性,其基因序列具有较强的保守性,是昆虫病原线虫共生菌复合体杀虫过程中的一种关键因子。

嗜线虫致病杆菌CB6菌株对小菜蛾幼虫生物活性的研究

用叶碟法测定了嗜线虫致病杆菌CB6菌株发酵液对小菜蛾幼虫的致死率、拒食活性以及对生长发育的影响。结果表明 ,其发酵液对幼虫有较高的生物活性 ,取食 3d后 ,1～ 3龄幼虫的校正死亡率分别为 84 75 %、6 8 33%和 5 9 32 %。 4龄幼虫取食量显著减少 ,选择性拒食率为 76 5 9% ,非选择性拒食率为 6 9 72 %。 3龄幼虫取食发酵液处理的叶片后 ,生长极其缓慢 ,在 4 8h时体重抑制率达 10 0 % ,化蛹率和羽化率均明显下降 ,其中化蛹率仅为 15 5 6 % ,10 0 %蛹不能羽化。

嗜线虫致病杆菌代谢物对马铃薯晚疫病菌的抑制作用

采用室内平板抑制法测定的结果表明 :嗜线虫致病杆菌发酵液对马铃薯晚疫病菌有很强的抑制生长作用 ,6～ 5 0 ml/ L的发酵液对菌丝生长的抑制率达 90 %～ 1 0 0 % ,1 .5～ 3ml/ L的发酵液仍有 70 %左右的抑制效果。发酵液对菌丝生长有抑制作用 ,但不能完全杀死菌丝 ;发酵液对孢子囊萌发也有一定的抑制作用 ,5 0 ml/ L的发酵液对孢子囊萌发的抑制率达 5 0 % ;发酵液在 2 4小时内能渗透到种薯内 3cm,抑制薯块内病菌的生长。因此 ,代谢物将有可能用于种薯处理 ,延缓或控制病害的流行。

嗜线虫致病杆菌CB6菌株胞内外杀虫蛋白的纯化及比较研究

【目的】分离和纯化嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophila var.pekingensis)CB6菌株胞内和胞外杀虫蛋白,鉴定其蛋白种类。为进一步利用此类杀虫蛋白奠定基础。【方法】采用硫酸铵沉淀、DEAESepharoseFF离子交换柱层析、Butyl SepharoseFF疏水柱层析和SephacrylS-200HR凝胶过滤对该类蛋白进行分离和纯化,采用Native-PAGE和SDS-PAGE技术对所纯化蛋白进行组分分析。【结果】获得达电泳纯的胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2。以2.58μg·ml-1含量E1、以4.21μg·ml-1含量E2喂饲棉铃虫初孵幼虫,对幼虫的生长抑制率分别达62.63%和97.9%。E1、E2经相同纯化参数处理获得的洗脱图相似,经native-PAGE和SDS-PAGE呈现出相似的单带电泳图谱。SDS-PAGE测得E1、E2表观分子量大于212kD,该杀虫蛋白在60℃仍表现出较强的活性。电泳染色结果表明该类蛋白非糖蛋白也非酯蛋白。【结论】CB6菌株胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2可能是同一种(类)蛋白。

嗜线虫致病杆菌产生抗生素的培养基及条件

本文对嗜线虫致病杆菌 (Xenorhabdus nematophilus)产生抗生素的发酵培养基和发酵条件进行了研究 ,同时对该菌代谢过程 p H值、还原糖、总糖、氨基氮与抗生素产量的关系进行了分析。通过筛选该菌对碳源和氮源的要求 ,用正交试验初步确定了该菌产素的最佳发酵培养基和条件为 :玉米粉 1% ,大豆粉 3% ,蔗糖 1% ,蛋白胨 1.5% ,KH2 PO4 0 .0 2 % ,Mg SO4 0 .2 % ,活化剂 T0 .1% ;发酵培养基的起始 p H值在 6 .0～ 8.0 ,种龄 16 h,接种量 4 % ,50 0 m L摇瓶装量 15～ 150 m L的条件下培养 72 h可获得较高的抗生素产量 ;产素量与菌代谢过程中 p H、还原糖、总糖和氨基氮的变化有一定关系 ,通过培养基和培养条件的研究使该菌的产抗生素能力提高了 56 .3%。

嗜线虫致病杆菌的抑菌物质及抑菌活性

嗜线虫致病杆菌北京变种（Xenorhabdus nematophila var．pekingense）是从北京地区采集的小卷蛾斯氏线虫（Steinernema carpocapsae）肠道内分离的共生细菌，具有自主知识产权，分离纯化出其发酵代谢物中的抗菌物质，进行抗菌活性测定，对研究该菌的抑菌机理以及开发利用具有重要意义。本文从该菌株代谢物中分离获得的抗菌物质经紫外光谱、红外光谱、核磁共振、高分辨质谱以及理化性质分析，鉴定为Xenocoumacin 1。用平板含毒培养基法测定了该物质对12种植物病原真菌的抑菌活性。研究表明，分离的活性物质具有较强的抑制活性，浓度在10μg／mL时，对黄瓜疫霉病菌、苎麻疫霉病菌、辣椒疫霉病菌，西葫芦灰霉病菌，苹果斑点落叶病菌的菌丝抑制率为100％。对草莓疫病病菌、苹果腐烂病菌、苹果褐斑病菌、着茄灰霉病菌、苹果轮纹病菌抑制率分别为86.8％、79．4％、79．5％、62．6％、53．6％；对其中6种真菌的EC50为0．25-4．17 μg／mL，该物质对疫霉属真菌抑制作用最强，并能引起番茄晚疫病菌的菌丝生长畸形，原生质外溢。本文对开发新型生物杀菌剂的研究奠定了基础。

嗜线虫致病杆菌HB310菌株对东亚飞蝗的生物活性

通过生物测定比较了9种昆虫病原线虫共生菌对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis4龄蝗蝻的杀虫活性,其中嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310菌株(以下简称Xn HB310)对4龄蝗蝻的活性最高;采用浸叶法进一步测定了Xn HB310菌液对不同虫态的东亚飞蝗的毒力。结果表明:在饲喂96 h后,Xn HB310菌液对2龄蝗蝻、4龄蝗蝻和成虫的致死中浓度(LC50)分别为2.97×105、4.90×105和6.24×105CFU/mL,致死中时间(LT50)分别为51.48、52.59和64.34 h。研究还发现该菌株对东亚飞蝗具有明显的拒食活性,处理48 h后Xn HB310菌液对2龄蝗蝻、4龄蝗蝻和成虫的拒食中浓度(AFC50)分别为1.15×105、2.36×105和3.16×105CFU/mL。通过点滴或剪除东亚飞蝗成虫感觉器官的方法,证实了Xn HB310菌液对东亚飞蝗产生拒食作用的器官是下颚须和下唇须,剪除下颚须和下唇须及两者均剪除的拒食率分别为37.36%、51.28%和100%。研究结果表明,嗜线虫致病杆菌Xn HB310菌液对东亚飞蝗的杀虫速度快且活性高,具有开发为防治东亚飞蝗杀虫剂的潜力。

嗜线虫致病杆菌HB310培养基筛选和培养条件优化

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila是与小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae互惠共生的一种革兰氏阴性菌,对多种农业害虫都具有很高的杀虫活性。本研究对多种影响嗜线虫致病杆菌HB310菌株发酵培养的因素进行了筛选优化。通过单因素试验确定最佳碳源、氮源和无机盐分别为葡萄糖、牛肉蛋白胨和KH2PO4;通过正交实验确定培养基的最优组合为:葡萄糖2%、牛肉蛋白胨1%、牛肉浸膏0.3%和K2HPO41%;最佳摇瓶培养条件为:接种量6%、培养基p H 7.5、摇床转速200 rpm、培养温度28℃和培养时间48 h,在此条件下,嗜线虫致病杆菌HB310菌株生长速率最快,菌液的杀虫活性最高。

嗜线虫致病杆菌与七种杀虫剂混配对小菜蛾毒杀增效作用评价

采用浸叶法测定了嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310(Xn HB310)与7种常用杀虫剂混配后对小菜蛾3龄幼虫的毒杀增效作用,并对具有增效作用的混配组合进行了最佳配比的筛选和增效作用的评价。结果显示,Xn HB310仅与氯氰菊酯混配表现出明显的增效作用,协同毒力指数(cf)为30.9;当Xn HB310与氯氰菊酯质量比在1006.4∶2.6～816∶4之间时,混配药剂均表现为增效作用;当两种药剂的质量比为952∶3时,增效作用最强,此时的共毒系数最高为335。Xn HB310与乐斯本、吡虫啉或甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)混配均表现为相加作用,cf值分别为9.6、-6.9和-18.6,Xn HB310与菜喜、灭幼脲或阿维菌素混配则表现出明显的拮抗作用,cf值分别为-48.4、-24.9和-57.1。

高毒力杀虫细菌嗜线虫致病杆菌CB6菌株的培养基优化

用正交试验法研究了嗜线虫致病杆菌北京变种菌株CB6的营养利用以及培养基成分的改变对产生杀虫活性物质的影响。通过筛选该菌对碳源、氮源以及无机盐的需求,确定了该菌的最佳发酵培养基为(g/L):豆粉40g,蔗糖15g,蛋白胨15g,酵母膏10g,玉米浆5g,NaH2PO41g,NaCl5g,谷氨酸5g。培养液上清液对玉米螟初孵幼虫的体重抑制率为90 81%,比基础培养基的杀虫活性提高了46.5%。