嗜线虫致病杆菌HB310菌株对东亚飞蝗的生物活性

通过生物测定比较了9种昆虫病原线虫共生菌对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis4龄蝗蝻的杀虫活性,其中嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310菌株(以下简称Xn HB310)对4龄蝗蝻的活性最高;采用浸叶法进一步测定了Xn HB310菌液对不同虫态的东亚飞蝗的毒力。结果表明:在饲喂96 h后,Xn HB310菌液对2龄蝗蝻、4龄蝗蝻和成虫的致死中浓度(LC50)分别为2.97×105、4.90×105和6.24×105CFU/mL,致死中时间(LT50)分别为51.48、52.59和64.34 h。研究还发现该菌株对东亚飞蝗具有明显的拒食活性,处理48 h后Xn HB310菌液对2龄蝗蝻、4龄蝗蝻和成虫的拒食中浓度(AFC50)分别为1.15×105、2.36×105和3.16×105CFU/mL。通过点滴或剪除东亚飞蝗成虫感觉器官的方法,证实了Xn HB310菌液对东亚飞蝗产生拒食作用的器官是下颚须和下唇须,剪除下颚须和下唇须及两者均剪除的拒食率分别为37.36%、51.28%和100%。研究结果表明,嗜线虫致病杆菌Xn HB310菌液对东亚飞蝗的杀虫速度快且活性高,具有开发为防治东亚飞蝗杀虫剂的潜力。

嗜线虫致病杆菌HB310菌株杀虫蛋白的纯化及活性鉴定

嗜线虫致病杆菌XenorhabdusnematophilaHB310是从河北省土壤中筛选出的一株昆虫病原线虫体内分离纯化获得的共生菌,该菌的发酵液对多种昆虫有较高的杀虫活性。利用85%饱和度的硫酸铵盐析分别获得胞内蛋白提取物和上清液中胞外蛋白提取物,生测结果表明这两种蛋白提取物中都含有胃毒素和血腔毒素。通过制备型非变性凝胶电泳对蛋白提取物进行分离和纯化,得到了3种有杀虫活性的毒素蛋白(毒素Ⅰ、毒素Ⅱ和毒素Ⅲ),胞内的毒素蛋白与分泌到胞外上清液中的毒素蛋白是同种蛋白。毒素Ⅰ和毒素Ⅱ对棉铃虫初孵幼虫有明显的胃毒活性,但没有血腔毒性;毒素Ⅲ对大蜡螟幼虫有很强的血腔毒性,LD50为0.18μg头。SDS_PAGE图谱显示毒素Ⅰ和毒素Ⅱ是由多个多肽组成的复合蛋白,而毒素Ⅲ只分离出一条多肽。毒素Ⅱ在50℃处理10min,其杀虫活性没有显著变化;70℃处理10min对毒素Ⅲ杀虫活性没有显著影响。

嗜线虫致病杆菌HB310培养基筛选和培养条件优化

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila是与小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae互惠共生的一种革兰氏阴性菌,对多种农业害虫都具有很高的杀虫活性。本研究对多种影响嗜线虫致病杆菌HB310菌株发酵培养的因素进行了筛选优化。通过单因素试验确定最佳碳源、氮源和无机盐分别为葡萄糖、牛肉蛋白胨和KH2PO4;通过正交实验确定培养基的最优组合为:葡萄糖2%、牛肉蛋白胨1%、牛肉浸膏0.3%和K2HPO41%;最佳摇瓶培养条件为:接种量6%、培养基p H 7.5、摇床转速200 rpm、培养温度28℃和培养时间48 h,在此条件下,嗜线虫致病杆菌HB310菌株生长速率最快,菌液的杀虫活性最高。

嗜线虫致病杆菌HB310几丁质酶基因chi70的克隆和表达

为了了解嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila几丁质酶的功能,本研究通过PCR技术从X.nematophila HB310菌株中克隆得到了几丁质酶基因chi70,对该基因进行了生物信息学分析。结果表明该基因全长1947 bp,编码648个氨基酸,表达的Chi70蛋白不含信号肽。将chi70基因进行原核表达,获得大量重组Chi70蛋白。采用二硝基水杨酸法(DNS法)测定重组蛋白酶活,结果表明几丁质酶Chi70在pH7.0时活性最高,为8.815 U/mL。采用生测方法测定Chi70对苏云金芽孢杆菌HD-73(Bt HD-73)的增效活性,结果表明单独使用Bt HD-73时对2龄棉铃虫幼虫的LC50为14.80μg/m L,添加Chi70后的Bt HD-73对2龄棉铃虫幼虫的LC50为5.66μg/m L,实验结果说明Chi70对Bt具有明显的增效作用。

嗜线虫致病杆菌HB310对五种苹果病原菌抑菌活性的影响

以苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌、苹果黑斑病菌、苹果斑点落叶病菌和苹果灰霉病菌为供试菌种,采用生长速率法和孢子萌发法测定嗜线虫致病杆菌HB310的发酵液和上清液对病原菌菌丝生长发育的抑制作用及对孢子萌发的影响。结果表明:嗜线虫致病杆菌HB310发酵液和上清液对苹果轮纹菌菌丝生长的抑制效果最好,抑制率分别为76.90%和80.79%。嗜线虫致病杆菌HB310发酵液致使苹果腐烂病原菌菌丝形态异常;浓度为50和25mL/L的嗜线虫致病杆菌HB310对供试苹果病原真菌的孢子萌发均有很好的抑制作用,抑制率均在98%以上。嗜线虫致病杆菌HB310对苹果病原真菌的菌丝和孢子均具有较好的抑制作用。

嗜线虫致病杆菌HB310菌株对家蚕的毒力及安全性评价

嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)HB310菌株与小卷蛾斯氏线(Steinernema carpocapsae)互助共生,对多种寄生害虫具有杀灭作用。为了探讨该共生菌在蚕区大田农作物害虫防治上应用的可行性,研究了嗜线虫致病杆菌HB310菌液和蛋白毒素粗提物对家蚕的生物学安全性。结果表明:HB310菌液对家蚕的急性毒力很低,即使在处理后120h,仍然不能测定其LC50;家蚕对HB310菌液和蛋白毒素粗提物均表现出一定的拒食性,5龄幼虫对2.24×106CFU/mL HB310原菌液和0.57mg/mL杀虫蛋白粗提物的48h拒食率分别达到24.90%和23.05%;HB310菌液及蛋白毒素粗提物对家蚕各龄幼虫体重均有明显的抑制作用,并且随龄期而增大;从蚁蚕开始一直饲喂含HB310原菌液人工饲料的幼虫各龄历期均明显延长,存活率显著下降,到4龄全部死亡;幼虫取食含HB310原菌液人工饲料72h后改饲喂正常饲料,1龄和2龄的历期明显长于对照,但以后各龄历期、化蛹率、羽化率、蛹重和茧层量等各项生物学和经济性状指标均与对照无显著差异;1.12×104CFU/mL HB310菌液和0.11mg/mL蛋白毒素粗提物对家蚕的生长发育无显著影响。综合分析认为,HB310菌株对家蚕低毒性。

嗜线虫致病杆菌HB310菌株对东亚飞蝗杀虫活性的研究

采用叶片浸渍法测定了嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila) HB310菌株对不同龄期东亚飞蝗蝗蝻(若虫)的口服胃毒活性。结果表明,菌液与细胞在相同浓度条件下对2龄和4龄蝗蝻杀虫活性无显著差异,但明显高于上清液活性(P<0.05);在高浓度(2.24×10~6cfu/mL)条件下,菌液和细胞对东亚飞蝗成虫致病力无差异,但随着浓度降低,菌液的活性明显高于细胞和上清液,且东亚飞蝗龄期越小敏感性越强。该菌株不同分子量胞内蛋白粗提物对不同龄期东亚飞蝗蝗蝻均具有很好的胃毒活性。其中,30 kDa蛋白粗提物饲喂处理96 h后,不同龄期东亚飞蝗蝗蝻的死亡率均达到90%以上。

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310对中红侧沟茧蜂的影响

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310(Xn HB310)是一株广谱高效的昆虫病原线虫共生细菌,本文以中红侧沟茧蜂Microplitis mediator为试虫,研究了菌株Xn HB310对其发育的影响。结果表明用2.24×106cfu.mL 1的Xn HB310菌液和567.60μg.mL 1的蛋白毒素直接浸渍蛹茧,对茧蜂羽化率没有影响。直接饲喂成蜂高浓度的菌液(≥1.12×105cfu.mL 1)或蛋白毒素(≥200μg.mL 1)会明显缩短成蜂的寿命。棉铃虫Helicoverpa armigera持续取食含1.12×103cfu.mL 1菌液的饲料,对所寄生的茧蜂无显著影响;棉铃虫持续取食含0.38μg.mL 1蛋白毒素的饲料,所寄生的茧蜂卵-幼虫历期显著延长,其它发育指标无影响。2龄棉铃虫接种茧蜂后分别饲喂含亚抑制中浓度菌液或蛋白毒素的饲料,对茧蜂均无显著影响。在自然条件下,茧蜂成虫不可能直接取食到高浓度的Xn HB310菌液或蛋白毒素,所以田间施用共生菌对该寄生蜂各虫态均是安全的。

嗜线虫致病杆菌杀虫毒素对棉铃虫的中肠组织病理学研究

嗜线虫致病杆菌HB310菌株与小卷蛾斯氏线虫HB310共生,对多种昆虫均具有较高生物活性。本实验通过盐析和非变性凝胶电泳等方法从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化出具胃毒活性的蛋白毒素Ⅱ。经毒素Ⅱ处理的棉铃虫幼虫,中肠组织的病理学变化类似于发光杆菌Tca毒素和Btδ-内毒素。棉铃虫4龄幼虫口服毒素Ⅱ6h后中肠组织开始发生变化:首先围食膜前端破碎,中肠柱状细胞伸长;随着时间推移,12h后整个围食膜被破坏消失,中肠组织病变加重,肠壁细胞排列疏松混乱;随着毒素作用的逐渐减弱,处理72h后棉铃虫中肠围食膜又重新出现。毒素Ⅱ离体处理棉铃虫围食膜,同样可以导致围食膜破碎。

嗜线虫致病杆菌血腔毒素Tp40对大蜡螟幼虫体内酶活性和中肠组织的影响

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila在侵入到寄主昆虫血腔后能够成功地逃避或抑制寄主昆虫的免疫反应并快速杀死昆虫。为深入了解嗜线虫致病杆菌的杀虫机理,明确关键的致病因子,作者应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法,从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化了一种新的杀虫蛋白——Tp40,该蛋白对大蜡螟Galleria mellonella具有高血腔注射活性,对大蜡螟5龄幼虫的LD50为68.54ng/头。本文检测了该毒素对大蜡螟幼虫的致病特性,注射Tp40毒素后,大蜡螟幼虫表现出兴奋和痉挛等症状,当以不低于(70±0.02)ng/头的剂量注射Tp40,大蜡螟幼虫均在20min内死亡,但试虫的体色、血淋巴的颜色以及血细胞的形态没有发生明显的变化。对大蜡螟体内酶活性的测定结果显示,在注射LD50剂量的Tp40蛋白后,试虫体内羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活力都明显的高于对照(P<0.05),而酚氧化酶活力显著低于对照(P<0.05)。对大蜡螟幼虫中肠的组织病理学研究显示:这种42kDa蛋白能够破坏试虫的中肠组织,导致其肠壁细胞出现排列紊乱、脱落和围食膜消失。据此推测,Tp40与嗜线虫致病杆菌对寄主昆虫的免疫抑制有关,寄主中肠组织可能是其作用靶标之一。

嗜线虫致病杆菌代谢物拮抗大豆疫霉

测定嗜线虫致病杆菌 (Xenorhabdusnematophilus)发酵液对大豆疫霉 (Phytophthorasojae )菌丝生长、孢子囊形成及萌发的影响 ,采用种子和土壤处理的方法研究了发酵液对幼苗发病率的作用。结果表明 :发酵液对大豆疫霉 (Phytophthorasojae)菌丝生长有较强的抑制作用 ,5 0ml/L发酵液能完全抑制菌丝的生长 ,6ml/L发酵液的抑制率仍达 6 8.86 % ;发酵液能强烈抑制大豆疫霉的孢子囊形成 ,10ml/L - 10 0ml/L的发酵液处理孢子囊 8天后的抑制率分别达 97.0 4 %和 99.19% ,5ml/L发酵液仍达到 82 .74 %的抑制率 ;发酵液对孢子囊的萌发有一定抑制作用 ,处理后 4 8小时 ,6ml/L - 10 0ml/L发酵液的抑制率达 72 .94 % - 88.5 6 % ;发酵液浸种结果表明 ,发酵液浓度为2 5ml/L - 5 0ml/L对大豆种子萌发均没有显著影响。用浓度为 5 0ml/L的发酵液处理种子 ,播种后9天 ,病株减退率可达 79.8% ,但 12天调查 ,病株减退率仅达 34.4 %。发酵液处理带菌土壤能有效减轻大豆幼苗的发病率 ,5 0ml/L发酵液处理的病株减退率为 76 .3% ,化学农药甲霜灵处理的病株减退率为 84 .0 %。

嗜线虫致病杆菌血腔毒素Tp40的纯化和特性分析

【目的】嗜线虫致病杆菌是一种昆虫病原线虫共生菌,它能够产生多种杀虫毒素。本研究旨在从嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310菌株的细胞内纯化新的杀虫蛋白毒素,并对其进行基因克隆和序列分析。【方法】应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法纯化蛋白,再通过对5龄大蜡螟幼虫血腔注射进行活性筛选。对获得的目的蛋白与已知蛋白进行同源分析,克隆出该目的蛋白的基因序列,从而进行相应的基因和氨基酸序列分析。【结果】本研究纯化的Tp40蛋白对大蜡螟LD50为68.54ng/头,其SDS-PAGE电泳图谱只显示出一条分子量约为42kDa的多肽。Western印迹分析表明Tp40与已知的Txp40为同源蛋白,并且仅存在于细胞内。编码该蛋白的基因开放读码框全长1107bp(GenBank登录号:EU095326),编码368个氨基酸残基,预测分子量为41.5kDa,等电点为8.66,与GenBank中的其余13株昆虫病原线虫共生菌所包含的相似基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为85%～99%和70%～99%。【结论】Tp40蛋白具有很高的血腔杀虫活性,其基因序列具有较强的保守性,是昆虫病原线虫共生菌复合体杀虫过程中的一种关键因子。

嗜线虫致病杆菌代谢物对马铃薯晚疫病菌的抑制作用

采用室内平板抑制法测定的结果表明 :嗜线虫致病杆菌发酵液对马铃薯晚疫病菌有很强的抑制生长作用 ,6～ 5 0 ml/ L的发酵液对菌丝生长的抑制率达 90 %～ 1 0 0 % ,1 .5～ 3ml/ L的发酵液仍有 70 %左右的抑制效果。发酵液对菌丝生长有抑制作用 ,但不能完全杀死菌丝 ;发酵液对孢子囊萌发也有一定的抑制作用 ,5 0 ml/ L的发酵液对孢子囊萌发的抑制率达 5 0 % ;发酵液在 2 4小时内能渗透到种薯内 3cm,抑制薯块内病菌的生长。因此 ,代谢物将有可能用于种薯处理 ,延缓或控制病害的流行。

嗜线虫致病杆菌CB6菌株对小菜蛾幼虫生物活性的研究

用叶碟法测定了嗜线虫致病杆菌CB6菌株发酵液对小菜蛾幼虫的致死率、拒食活性以及对生长发育的影响。结果表明 ,其发酵液对幼虫有较高的生物活性 ,取食 3d后 ,1～ 3龄幼虫的校正死亡率分别为 84 75 %、6 8 33%和 5 9 32 %。 4龄幼虫取食量显著减少 ,选择性拒食率为 76 5 9% ,非选择性拒食率为 6 9 72 %。 3龄幼虫取食发酵液处理的叶片后 ,生长极其缓慢 ,在 4 8h时体重抑制率达 10 0 % ,化蛹率和羽化率均明显下降 ,其中化蛹率仅为 15 5 6 % ,10 0 %蛹不能羽化。

嗜线虫致病杆菌CB6菌株胞内外杀虫蛋白的纯化及比较研究

【目的】分离和纯化嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophila var.pekingensis)CB6菌株胞内和胞外杀虫蛋白,鉴定其蛋白种类。为进一步利用此类杀虫蛋白奠定基础。【方法】采用硫酸铵沉淀、DEAESepharoseFF离子交换柱层析、Butyl SepharoseFF疏水柱层析和SephacrylS-200HR凝胶过滤对该类蛋白进行分离和纯化,采用Native-PAGE和SDS-PAGE技术对所纯化蛋白进行组分分析。【结果】获得达电泳纯的胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2。以2.58μg·ml-1含量E1、以4.21μg·ml-1含量E2喂饲棉铃虫初孵幼虫,对幼虫的生长抑制率分别达62.63%和97.9%。E1、E2经相同纯化参数处理获得的洗脱图相似,经native-PAGE和SDS-PAGE呈现出相似的单带电泳图谱。SDS-PAGE测得E1、E2表观分子量大于212kD,该杀虫蛋白在60℃仍表现出较强的活性。电泳染色结果表明该类蛋白非糖蛋白也非酯蛋白。【结论】CB6菌株胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2可能是同一种(类)蛋白。

嗜线虫致病杆菌产生抗生素的培养基及条件

本文对嗜线虫致病杆菌 (Xenorhabdus nematophilus)产生抗生素的发酵培养基和发酵条件进行了研究 ,同时对该菌代谢过程 p H值、还原糖、总糖、氨基氮与抗生素产量的关系进行了分析。通过筛选该菌对碳源和氮源的要求 ,用正交试验初步确定了该菌产素的最佳发酵培养基和条件为 :玉米粉 1% ,大豆粉 3% ,蔗糖 1% ,蛋白胨 1.5% ,KH2 PO4 0 .0 2 % ,Mg SO4 0 .2 % ,活化剂 T0 .1% ;发酵培养基的起始 p H值在 6 .0～ 8.0 ,种龄 16 h,接种量 4 % ,50 0 m L摇瓶装量 15～ 150 m L的条件下培养 72 h可获得较高的抗生素产量 ;产素量与菌代谢过程中 p H、还原糖、总糖和氨基氮的变化有一定关系 ,通过培养基和培养条件的研究使该菌的产抗生素能力提高了 56 .3%。

嗜线虫致病杆菌与七种杀虫剂混配对小菜蛾毒杀增效作用评价

采用浸叶法测定了嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310(Xn HB310)与7种常用杀虫剂混配后对小菜蛾3龄幼虫的毒杀增效作用,并对具有增效作用的混配组合进行了最佳配比的筛选和增效作用的评价。结果显示,Xn HB310仅与氯氰菊酯混配表现出明显的增效作用,协同毒力指数(cf)为30.9;当Xn HB310与氯氰菊酯质量比在1006.4∶2.6～816∶4之间时,混配药剂均表现为增效作用;当两种药剂的质量比为952∶3时,增效作用最强,此时的共毒系数最高为335。Xn HB310与乐斯本、吡虫啉或甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)混配均表现为相加作用,cf值分别为9.6、-6.9和-18.6,Xn HB310与菜喜、灭幼脲或阿维菌素混配则表现出明显的拮抗作用,cf值分别为-48.4、-24.9和-57.1。

高毒力杀虫细菌嗜线虫致病杆菌CB6菌株的培养基优化

用正交试验法研究了嗜线虫致病杆菌北京变种菌株CB6的营养利用以及培养基成分的改变对产生杀虫活性物质的影响。通过筛选该菌对碳源、氮源以及无机盐的需求,确定了该菌的最佳发酵培养基为(g/L):豆粉40g,蔗糖15g,蛋白胨15g,酵母膏10g,玉米浆5g,NaH2PO41g,NaCl5g,谷氨酸5g。培养液上清液对玉米螟初孵幼虫的体重抑制率为90 81%,比基础培养基的杀虫活性提高了46.5%。