来源于酸热脂环酸杆菌的嗜酸性α-淀粉酶的表达研究

从嗜酸耐热的酸热脂环酸杆菌Alicyclobacillusacidocaldarius中克隆到α_淀粉酶的基因 (amy) ,该基因全长 390 3bp ,编码130 1个氨基酸 ,理论分子量约 14 0kD。将基因amy分别克隆到大肠杆菌E .coli表达载体pET_2 2b(+)和毕赤酵母P .pastoris表达载体pPIC9α ,并在大肠杆菌和毕赤酵母中得到了表达 ,表达产物具有淀粉酶的活性。对酵母中表达的酶蛋白AMY进行了纯化 ,并初步研究了它的酶学性质 ,它的作用最适pH 3 2 ,在pH 2 5～ 4 6范围内 ,酶活性保留 5 0 %以上 ,它的最适温度 6 5℃ ,在 70℃下处理 30min ,酶活性维持 5 0 %以上 ,基本保留了天然酶蛋白的耐热性和嗜酸性。位于基因amy内部 +1174～+32 88bp的基因片段amy′全长 2 115bp ,编码 70 5个氨基酸 ,在E .coli表达后依然具有淀粉酶的活性。

极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

为探索极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600)中的高效分泌表达条件,对来源于枯草芽孢杆菌的9种Sec分泌途径信号肽进行筛选,结果显示信号肽Yfk N的引导分泌效率最高。在此基础上,为进一步优化PFA的分泌表达,对信号肽Yfk N的Ile3和Gln4进行饱和突变,并比较不同突变体的引导分泌效率。结果表明突变体I3G/Q4R的引导分泌效率最高,重组枯草芽孢杆菌的胞外α-淀粉酶活力高达715 U/m L。重组α-淀粉酶PFA的最适反应p H值为5.0,最适反应温度为100℃,于100℃的半衰期长达13 h,并且不依赖于Ca^(2+)。结果表明,采用信号肽I3G/Q4R,极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达,这有利于其在淀粉液化工艺中的应用。

嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy中结构域C的环化重排及其对Gt-amy催化性能的影响

为确定嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy中结构域C对其催化性能的影响,本研究采用基于蛋白质分子结构的环化重排方法对Gt-amy的结构域C进行分子改造,获得Gt-amy环化重排突变体,并比较了突变体的生淀粉吸附率、生淀粉降解率、酶比活力以及动力学常数.与Gt-amy相比,生淀粉吸附能力提高的Gt-amy环化重排突变体,其生淀粉降解能力也得到提高;生淀粉吸附能力降低的Gt-amy环化重排突变体,其生淀粉降解能力也降低.即Gt-amy的生淀粉降解能力和生淀粉吸附能力之间存在正相关性.其中,环化重排突变体Gt-amy-S498的生淀粉吸附率由78.86%提高至93.14%,生淀粉降解率由65.80%提高至90.93%.本研究证实环化重排突变可以作为一种工程学手段改变蛋白质的结构与功能,为提高酶类蛋白质的催化性能提供了思路.

D407A/D430A双位点突变对嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶GTamy酶学性质的影响

旨在研究位于嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶GTamy的结构域A与生淀粉结合域RSBD间的Ca^(2+)结合位点对其酶学性质的影响,构建了GTamy的Ca^(2+)结合位点突变体GTamy D407A/D430A,并比较了GTamy与突变体GTamy D407A/D430A的酶学性质。结果表明,与GTamy相比,突变体的高温活性和热稳定性明显降低。突变体于80℃的比活力由1 756.75 U/mg降低至1 484.48 U/mg;80℃的半衰期由3 h降低至2.5 h。以可溶性淀粉为底物时,突变体的底物结合能力不变,反应速率为GTamy的79%;以玉米淀粉为底物时,突变体的底物吸附率为GTamy的67.9%,底物降解率为GTamy的59.3%。该Ca^(2+)结合位点可能通过改变RSBD和催化活性中心的分子结构来影响GTamy的高温活性和热稳定性。本研究表明该Ca^(2+)结合位点有利于GTamy维持高温活性和热稳定性。

N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶ApkA酶学性质的影响

为探索N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶Apk A酶学性质的影响,同时为构建酵母工程菌奠定基础,将Apk A缺失信号肽突变体Apk Ads及含有2个潜在N-糖基化修饰位点的突变体Apk Ads D182N/G373S在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。Apk Ads和Apk Ads D182N/G373S在Pichia pastoris GS115中大量表达并分泌到胞外,Apk Ads的表观分子质量约为45 k D,Apk Ads D182N/G373S的表观分子质量约为55 k D。酶学性质分析表明,与Apk Ads相比,Apk Ads D182N/G373S的酶学性质发生了一定的变化。其最适反应p H值由6.5降低至5.5~6.0,酸性条件下稳定性增强;最适反应温度由90℃提高至100℃;于90℃的半衰期由5 h增加至5.5 h,于100℃保温10 min后的相对酶活力由32.03%增加至49.04%。结果表明N-糖基化修饰可适当提高Apk A的酸性条件下酶活力和稳定性、最适反应温度、热稳定性。突变体Apk Ads D182N/G373S的酶学性质使其适于淀粉液化工艺的应用。

嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的C末端结构域功能及生淀粉结合位点分析

为确定嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy中参与生淀粉结合的结构区域,对Gt-amy的C末端结构域(C-terminal domain,CTD)进行缺失突变,并比较Gt-amy及CTD缺失突变体Gt-amy-T的酶学性质。在与Gt-amy相同的条件下,Gt-amy-T不能结合和降解玉米淀粉,CTD可有效结合玉米淀粉。以可溶性淀粉为底物,Gt-amy-T的kcat值约为Gt-amy的77.9%。CTD的系统进化关系分析显示CTD不是典型的淀粉结合结构域,但是本研究证实CTD属于生淀粉结合结构域,在Gt-amy结合并降解生淀粉中发挥重要作用,并且CTD有利于Gt-amy发挥可溶性淀粉酶活力。此外,本研究将CTD中Tyr残基定点突变为Ala残基,通过比较CTD与突变体的玉米淀粉结合能力以及Gt-amy与Gt-amy W501A/W514A的玉米淀粉结合率和降解率,确定CTD中W501和W514可能是生淀粉结合位点。

组成型分泌表达嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶的重组粪肠球菌的构建

该研究以高效组成型启动子P10替换pSIP401-gtamyhds中诱导型启动子,构建重组载体pSIP401Z-gtamyhds,并以其为基础框架,分别导入粪肠球菌(Enterococcus faecalis)来源的8种信号肽(s1~s8),采用电转化法将信号肽筛选载体转入具有优良益生特性的粪肠球菌EXW27,构建组成型分泌表达嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的重组粪肠球菌。以发酵上清液中α-淀粉酶活性为评价指标,对8种信号肽进行筛选,并对嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy进行分离纯化和酶学性质研究。结果表明,信号肽s7对嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的分泌效率最高,发酵上清液中α-淀粉酶活性达到310 U/m L。重组Gt-amy的最适反应pH值为5.0,在pH 4.0~8.0范围内具有较好的稳定性,最适反应温度为80℃,于80℃的半衰期为3 h,在40℃条件下反应3 h,对玉米淀粉的降解率可达55.8%。