1株古细菌海藻糖合成酶系在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

来源于古细菌嗜酸硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosylterhalose synthase,MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyltrehalose trehalohydrolase,MTHase)联合作用,可以利用淀粉为底物生成海藻糖。本研究构建了6种枯草芽孢杆菌一大肠杆菌穿梭表达载体,将密码子优化后的MTSase和MTHase编码基因在木糖异构酶基因的启动子及其阻遏蛋白介导下实现了在枯草芽孢杆菌中的功能表达,木糖启动子分别来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。在以5 g/L甘油为碳源,24 g/L蛋白胨为氮源时,菌体培养8 h后加入终质量浓度为6 g/L的木糖,37℃诱导16 h后重组MTSase、MTHase产生联合作用,海藻糖转化率达到33.57%。实现了MTSase、MTHase在枯草芽孢杆菌中的功能表达。

嗜酸嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius编码尿嘧啶DNA糖苷酶表达,纯化与酶学特征

【目的】嗜高温微生物面临d C脱氨基生成d U损伤的巨大压力,鉴定嗜酸嗜热古菌S.acidocaldarius来源的尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)切除d U损伤的酶学活性。【方法】重组表达来源于S.acidocaldarius的IV和V型UDG,经亲和纯化得到电泳纯重组蛋白。然后利用人工合成的d U(deoxyuracil)修饰寡核苷酸片段作为底物,体外鉴定两种重组UDG的酶学特性。【结果】来源于S.acidocaldarius的IV和V型重组UDG具有相似的酶学特性。IV型UDG催化效率更高,比活性是V型重组UDG的750倍左右。作为来自嗜热微生物的蛋白,S.acidocaldarius的IV和V型UDG的最适反应温度为65-75℃。【结论】IV型UDG比V型UDG水解d U碱基和脱氧核糖之间糖苷键的能力更强。

嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V的重组表达与酶学特征

【目的】表达纯化嗜酸嗜热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的核酸内切酶V(Saci_0544),对其核酸内切酶活性及酶学特征进行探究。【方法】将Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V(SacEndoV)在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到目标蛋白;利用带有不同类型损伤的寡核苷酸作为底物,结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定SacEndoV对相应损伤寡核苷酸底物的剪切活性。【结果】SacEndoV特异性剪切含脱氧肌苷(Deoxyinosine)的损伤DNA底物,明显偏好单链DNA底物。SacEndoV在70–95℃温度范围内酶活性高,酶活性依赖于二价金属离子,Mg^(2+)为最佳辅助离子,其最佳反应pH为7.5–8.0,高于200 mmol/L的NaCl会明显抑制其剪切活性。损伤DNA中脱氧肌苷3′端相邻的脱氧核糖核苷酸的结构完整性对于SacEndoV识别并剪切相应底物具有重要影响,脱氧肌苷3′端无碱基位点的存在使得SacEndoV不能够切断损伤DNA。此外,经测定SacEndoV对于含肌苷的损伤RNA底物具有剪切活性。【结论】本研究证实SacEndoV是一种典型的核酸内切酶V,对含脱氧肌苷的损伤DNA具有特异性的内切酶活性,推测其在Sulfolobus acidocaldarius体内参与脱氧肌苷的切除修复。

易错PCR技术提高源于Sulfolobus acidocaldarius麦芽寡糖基海藻糖合成酶活性

利用易错PCR技术结合高通量筛选技术对源于Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909的MTSase进行定向进化,获得一个酶活提高的突变体酶D-6。基因分析表明,突变体酶发生了2个位点突变:G432D/G586D,其中突变位点G586D位于Aβ8与AEα14的loop环上。将野生型MTSase和突变体酶D-6进行蛋白质纯化后,测定其酶学性质,结果表明:突变体酶D-6的比活力为野生型MTSase的1.22倍;野生型的Km值为4.74 mmol/L,而突变体D-6为2.77 mmol/L,表明其对底物亲和性较野生型有所提高。

Sulfolobus acidocaldarius DHH超家族核酸酶Saci0542的酶学特征研究

【目的】以嗜酸嗜热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的DHH超家族核酸酶(Saci0542)为例,研究其核酸外切酶活性特点,为阐明其在DNA代谢中的具体功能提供生化基础。【方法】将嗜酸嗜热硫化叶菌DHH超家族核酸酶Saci0542基因在大肠杆菌中重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯的重组蛋白;利用荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定Saci0542的酶学特征。【结果】重组表达的DHH超家族核酸酶Saci0542具有典型的单链核酸特异性的3ʹ-5ʹ外切酶活性。进一步酶学特征表征结果如下:酶活性依赖于二价金属离子Mn^(2+),而Ca^(2+)、Mg^(2+)、Zn^(2+)等二价金属离子对活性没有明显的促进作用;Saci0542在pH 5.5–10的广泛范围内均表现出较高酶活性;高于200 mmol/L的NaCl强烈抑制酶活性;最适反应温度为50–55°C;末端磷酸基团抑制3ʹ-5ʹ外切酶活性。【结论】本研究证实,Saci0542是一种Mn^(2+)依赖型3ʹ-5ʹ外切酶,酶活性与NrnA核酸酶相似,可能在细胞内负责DNA修复或RNA的降解再循环利用。

Sulfolobus acidocaldarius DNA聚合酶Ⅳ跨越损伤合成能力的酶学特征

【目的】以嗜酸嗜热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的DNA聚合酶Ⅳ (Saci_0554)为例,表征其跨越模板上损伤碱基的DNA合成效果。【方法】将DNA聚合酶Ⅳ (SacpolⅣ)在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到SacpolⅣ蛋白;利用人工合成的带有不同损伤的寡核苷酸片段作为模板DNA,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定SacpolⅣ在体外跨越各种损伤碱基进行跨损伤合成的催化能力。【结果】SacpolⅣ重组蛋白能够不同程度地跨越嘌呤和嘧啶损伤,跨越能力的高低取决于损伤碱基与正常碱基形成氢键的能力。本研究还发现,SacpolⅣ能够在DNA链中掺入核糖核苷酸,但掺入核糖核苷酸的效率低于脱氧核糖核苷酸。【结论】本研究证实SacpolⅣ具有很强的跨越损伤合成能力,能够跨越多种氢键配对能力减弱的损伤碱基,为其在细胞内的跨越损伤合成功能提供了生化证据。