嗜铬颗粒蛋白B-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建小鼠嗜铬颗粒蛋白B(chromogranin B,CgB)重组原核表达载体。方法先用RT-PCR方法从小鼠脑基因组中扩增出CgB基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pMD-T vector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中进行表达。结果表达产物经Western Blot分析,在140处有一明显特异带,与预期结果相符。结论构建重组融合表达载体pGEX-CgB,在原核细胞中成功表达出小鼠CgB-GST融合蛋白。

嗜铬颗粒蛋白B与热休克同源蛋白70相互作用的研究

目的分离和鉴别在肾上腺髓质嗜铬颗粒细胞分泌囊泡中,与嗜铬颗粒蛋白B(CgB)相互作用的蛋白质。方法采用蛋白质捕获、免疫共沉淀和质谱等技术进行研究。结果在嗜铬颗粒细胞内,CgB与热休克同源蛋白70(Hsc70)相互作用。一个Hsc70结合序列定位在CgB的羧基末端区(Ser586-Arg602,SR-17),而且SR-17内的Ser595磷酸化可增强其与Hsc70结合。磷酸化修饰的SR-17可从ATP-Sepharose上洗脱Hsc70。用免疫印迹和免疫组化方法可证实CgB和Hsc70均存在于嗜铬颗粒细胞的胞质和细胞核中。结论Hsc70可能参与CgB的细胞核转位过程。

利用定量蛋白质组学分析鉴定醛固酮腺瘤中新型生物标志物和通路

目的本研究旨在通过对接受肾上腺切除术的患者采集的醛固酮腺瘤(aldosterone-producing adenoma,APA)组织进行无标记定量蛋白质组学分析,筛选APA组织和正常肾上腺组织之间差异表达的蛋白。方法利用无标记定量蛋白质组学技术对APA及正常肾上腺组织进行分析,筛选APA组织和正常肾上腺组织之间差异表达的蛋白。采用免疫组化染色对APA病人组织样本染色,验证差异表达蛋白的表达。结果共鉴定了6282种蛋白质。使用P<0.05和|fold change|≥2的显著性截断值,鉴定出356种差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs)。此外,通过整合蛋白质组和转录组数据,鉴定出一个新的生物标志物嗜铬蛋白B(chromogranin B,CHGB),在APA中显著表达下调,并进一步通过免疫组化染色得到了进一步验证。受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析显示,CHGB在区分正常组织和APA方面具有较高的特异性(AUC=0.856),显示其在APA发展中的潜在重要性。重要的是,CHGB和CYP11B2的联合提高了诊断APA的预测效能。结论我们的研究确定了参与APA发生的关键蛋白质和通路,并发现了一种新的蛋白质生物标志物来区分APA,可能成为预测APA的潜在生物标记物。这些发现为未来APA的分子诊断研究提供了理论依据。